卵巢卵泡發育

卵巢卵泡發育是指胎兒發育至6周時，始基生殖細胞（卵母細胞）已從卵黃囊中之其起源部位以阿米巴樣運動移至生殖嵴（假定的卵巢）.卵母細胞通過有絲分裂迅速增殖，直到第4個月。此後絕大多數衰萎消亡。在第3個月間，有些細胞停止有絲分裂而開始成熟分裂（減數分裂）.達第7個月時，所有成活的細胞皆停止於減數分裂前期的雙線期。在7~9月間，胎兒卵巢已組成，每一個卵母細胞則成為一個始基卵泡的一部分。而每個始基卵泡包含了一層基膜，單層鱗狀上皮顆粒細胞和一個卵母細胞。始基卵泡組成了休止卵泡池，以後創建成一個生長池（所有的成熟卵泡都從此池發育）或萎縮。

概述

發動卵泡與卵母細胞的生長機制尚不清楚，但並不需要促性腺激素。

女子出生時只保存了有限的卵子數，它們中的99.9%將萎縮而消亡。由於每一個卵母細胞保持抑制狀態於分裂初期直到排卵，故它是體內的一個最長命的細胞(從胚胎到50歲左右)。這長命的跨度可能是高齡母親中遺傳性異常妊娠發生率增高的原因。

在婦女的生殖年歲間，每個周期在生長池內的數個卵泡參與生長,但往往只有一個被選作排卵。它發展成一個囊狀卵泡，並對月經中期的LH高峰有反應；其被選擇的機制尚不知曉。囊狀卵泡包含一個卵泡腔(充滿液體之腔)，其由增殖的顆粒細胞分泌的液體與粘多糖所建成。卵泡的增大主要是由於在FSH控制下卵泡液的積聚，FSH也誘導顆粒細胞上特有的LH受體的發育。LH受體對刺激排卵前孕酮的分泌與黃體期繼續產生孕酮負責，卵泡內的顆粒細胞也促使對催乳素特有膜受體的生長，後者的數目隨著卵泡的成熟而減少，它們的生理作用不明。

分離影響實驗

實驗概述

目的

評估機械法、酶解法和酶解?機械結合法等分離方法對小鼠移植卵巢分離卵泡的發育及其生殖潛能的影響，建立更好的卵泡分離技術方案。

方法B6D2F1新生小鼠卵巢移植後分別用機械法、長時酶解法、短時酶解法或酶解?機械結合法分離卵巢組織中的腔前卵泡，分離回收卵泡在體外培養12 d時加入絨毛膜促性腺激素(hCG)處理26 h，收穫卵丘複合體進行體外受精。

結果機械法的卵泡回收量、卵泡培養殘存率、排卵率均高於酶解法，短時酶解法的排卵率高於長時酶解法;酶解機械結合法的平均卵泡回收量、平均排卵數、卵母細胞成熟率等多項指標均高於其他各組。

結論酶解機械結合法是分離小鼠卵泡良好的技術方案。

卵巢 卵泡 培養技術 胚胎組織移植

人工誘導胚胎卵巢原始卵泡發育成熟可為受精機制研究和醫療性克隆提供充足的卵母細胞源。對異體移植髮育到一定程度的卵巢進行生長卵泡分離是人工誘導卵泡發育的關鍵步驟之一[1?3]，迄今已經發展出兩種卵泡分離技術，包括酶解分離法和機械分離法。這兩種方法各有其缺點，使每個卵巢的卵泡回收率和成熟率均停留於較低水平。本研究探討了酶解法、機械法和酶解?機械結合法等分離方法對小鼠移植卵巢分離卵泡的發育及其生殖潛能的影響，以期建立更好的卵泡分離技術方案。

材料與方法

1.1 動物 C57BL/6(B6)雌鼠、DBA/2(D2)雄鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[合格證：SCXK(滬)2007?005]，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1(F1)小鼠。小鼠飼養於恆溫(25 ℃)動物房單籠獨立通風系統(IVC?II型，蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)，光照14 h，黑暗10 h，自由飲水取食。

1.2 試劑 α?MEM?HEPES(42360?032)，α?MEM(32571?036)，膠原酶I(17100017)，脫氧核糖核酸酶(DNaseI，18047?019)及ITS(胰島素?轉鐵蛋白?硒混合物)均為美國Gibco公司產品; rFSH(注射用重組人促卵泡激素，瑞士Serono公司);LH(黃體生成素，美國Sigma公司);hCG(中國麗珠集團麗珠製藥廠);FCS(胎牛血清)，penicillin/streptomycin(青黴素/鏈黴素)及KSOM+AA(MR?106?D)均為美國Chemicon公司產品。

1.3 卵巢移植 B6雌鼠(8～10周齡)與D2雄鼠(10周齡)4∶1合籠培育F1代，次日查到陰栓者記為E0.5 d;以20 d為孕期，預產期前3 d每日早晚查看孕鼠是否生產;斷頸處死新生12 h以內F1小鼠，取出雙側卵巢待移植。異戊巴比妥(15 mg/mL)麻醉成年(8～10周)F1雌鼠(移植受體)。消毒小鼠背部，在肋脊角區做縱向切口進入腹腔，切除雙側卵巢，然後在左側腎被膜下植入新生小鼠卵巢2枚，層層縫合傷口。待受體鼠清醒後送回鼠舍。

1.4 卵泡分離 新生小鼠卵巢移植14 d後，將受體鼠斷頸處死，從腎被膜下取出移植的卵巢，卵巢移植物約2 mm大小，表面可見豐富的重構血管，在體視鏡下可清晰觀察到卵巢移植物中的卵泡。用1 mL注射器(320310，美國BD公司)的針尖將每枚卵巢均勻橫切為2塊，4塊卵巢組織混合後隨機分組進行分離。

1.4.1 A組(單純機械法) 將卵巢組織塊轉移至卵泡分離操作液(α?MEM?HEPES，10%FCS，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin，不含膠原酶和DNA酶)中，在帶有37 ℃恆溫熱盤(MATS?U55SZX2A，奧林巴斯)的體視顯微鏡下，用精細尖鑷 (直5#，T1?181，中國淮安特申醫療器械有限公司)剝離卵巢中的卵泡。每隔5 min，即將已剝離的完整卵泡轉移至事先裝有1 mL卵泡培養液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1%ITS)的35 mm培養皿中。共分離4次，總時間約20 min。

1.4.2 B組(長時酶解法) 將卵巢組織塊用1 mL注射器針尖均切為3小塊，置於500 μL卵泡酶解液(α?MEM?HEPES，3 mg/mL膠原酶I，1 mg/mL DNase I)中，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中消化20 min，第20分鐘時將其從培養箱取出，用200 μL移液槍吹吸消化液30次。在體視顯微鏡下將游離出的結構完整的卵泡轉移至事先裝有1 mL卵泡培養液的35 mm培養皿中。

1.4.3 C組(短時酶解法) 將卵巢組織塊用1 mL注射器針尖均切為3塊，置於500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中消化，每隔5 min即從培養箱中將組織取出，用200 μL移液槍吹吸消化液30次，在體視顯微鏡下觀察是否有游離的卵泡，如有則將卵泡迅速轉移至裝有1 mL新鮮培養液的35 mm培養皿中。共消化20 min。

1.4.4 D組(結合法) 將卵巢組織塊用1 mL注射器針尖均切成3塊，轉移至500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中消化5 min。然後在帶有37 ℃恆溫熱盤的體視顯微鏡下，在卵泡酶解液中用精細尖鑷分離卵泡。每分離5 min，即將已分離得到的完整的卵泡轉移至事先裝有1 mL卵泡培養液的35 mm培養皿中。共分離4次，20 min。

1.5 雙螢光染色 每組隨機選取部分分離卵泡，放入Calcein AM(4 mmol/L，Sigma，C1359)和Ethidium Homodimer?I(10 mmol/L，Sigma，E1903)混合液中，37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養45 min;卵泡懸液置倒置螢光顯微鏡觀察，在藍光的激發下，活的卵泡發綠色螢光，死的卵泡發紅色螢光，分別計數死、活卵泡數。

1.6 卵泡體外培養 各組分離所得卵泡分別進行體外培養12 d。第0天，分離得到的卵泡培養在加有1 mL培養液的35 mm培養皿中;第1天，加入1 mL新鮮培養液;此後每天半量換液;第12天全量換為卵泡成熟培養液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1% ITS，1.5 IU/mL hCG);第13天，在加入卵泡成熟培養液後26 h收集排出的卵丘複合體(OGCs)。

1.7 體外受精 每組的OGCs分別行體外受精。卵母細胞受精培養4 h後從受精滴中洗出，轉移至預先平衡過的KSOM+AA的小液滴中培養。觀察卵母細胞的成熟率(以含有第一極體的卵母細胞百分率代表)、受精率(以雙原核卵母細胞占有第一極體卵母細胞的百分率代表)。

1.8 統計學處理 採用SPSS 11.5軟分析。4組的卵泡存活率、培養卵泡各階段成熟率、排卵率運用單因素方差分析(one way ANOVA)，各組均數以最小顯著差法(least significant difference, LSD)進行兩兩比較和顯著性檢驗;卵母細胞成熟率和受精率採用χ2 檢驗。

結 果

2.1 分離卵泡回收量 經過分離操作後，顯微鏡下可見大量腔前卵泡，大部分卵泡呈圓或橢圓形，邊界清楚，部分卵泡外周附有或多或少的卵巢間質組織，卵母細胞成圓形，位於卵泡中央，透明帶清晰可見(圖1A)。體視鏡下回收卵泡邊界清晰、光滑的卵泡，計數各組回收卵泡量(表1)。表1 各組卵泡回收量比較

2.2 雙螢光染色結果 卵泡雙螢光染色後，在藍光的激發下，活細胞顯示綠色螢光，死亡細胞則呈紅色螢光。將卵母細胞呈綠色、卵泡細胞≥70%呈綠色者視為存活卵泡(圖1B)。各組活卵泡的百分率見表2。表2 各組卵泡存活率比較

2.3 卵泡體外培養結果 每組卵泡在相同條件下培養12 d，計數5、12 d的卵泡殘存率;在加入hCG 26 h後，計數排卵率。各組各項指標的結果見表3。表3 各組卵泡體外培養結果比較

2.4 體外受精結果 各組收穫OGCs分別受精，獲能精子密度控制在5×105 mL?1。早期胚置於KSOM+AA中培養，卵的密度為每20 μL含 15個。成熟率及受精率的計數結果見表4。D組成熟率高於其他3組，餘3組之間差別無統計學意義;受精率4個組之間無差別。表4 各組體外成熟與受精結果比較

討 論

近年來，多種哺乳動物，如小鼠、兔、豬及人的卵泡誘導發育技術體系都獲得了很大進展[4?7]。在這些體系中，大多傾向於將卵巢中的卵泡單獨分離出來後再進行培養。有報導表明，分離卵泡只有其基底膜未受損傷並帶有少量間質細胞、未成熟圓形卵母細胞位於其中央時，體外培養才能成功[8]。迄今常用的卵泡分離方法有兩種，包括利用水解酶(如鏈霉蛋白酶、膠原蛋白酶和脫氧核糖核酸酶)消化卵巢的結締組織而獲得游離卵泡的酶解法和用銳利器械剝離出卵泡的機械法[6,9?10]。就目前的資料來看，兩種方法各有優缺點。酶解法是細胞生物學研究中分離各種組織、器官中細胞的常用方法，因其操作簡便有效而受到普遍套用。酶解法分離卵泡時，普遍採用膠原蛋白酶和脫氧核糖核酸酶組合配製成分離液。這種分離液利用酶消化卵巢間質組織中的膠原蛋白，使卵泡從卵巢組織釋放出來，故在限定時間裡可望收穫較多的游離卵泡。有報導表明，用酶解法分離卵泡培養的卵母細胞可有更高成熟率和卵裂率的趨勢[11]。但是，分離液長時間浸泡卵巢組織時，顯然可能導致卵泡基底膜受到損傷，從而使卵泡在後續培養中更易於退化，降低了卵泡培養的殘存率，因此酶的作用濃度和時間是個關鍵的問題。

用機械法分離卵泡，如果操作手法得當，可能保持卵泡基底膜的完整，從而在體外培養過程中更容易維持卵泡的立體結構，保障更高的培養殘存率。Carrell等和Park等的結果顯示，用機械法分離的卵泡，其殘存率存活率顯著高於用酶解法分離者[12?13];Shen等還進一步利用機械法來源的小鼠卵泡培育成熟卵母細胞並成功製備了IVF?ET小鼠[4]。但是，也有報導表明，移植後卵巢切片顯示有些腔前卵泡的卵母細胞與其周圍顆粒細胞的聯繫很薄弱[14]。用機械法從緻密的卵巢間質組織中分離卵泡時，往往難於避免牽拉卵泡的力量過大，很容易破壞卵母細胞與顆粒細胞的連線，而卵母細胞和顆粒細胞的縫隙連線異常，會影響卵母細胞的發育並導致減數分裂阻斷[15?16]。故機械法能否保障卵泡存活率在很大程度上依賴於操作技巧，同時在有限的分離操作時間裡很難提高卵泡的回收量。從目前的報導來看，單用機械法從每枚卵巢中得到的卵泡數量非常有限，平均每個卵巢只有12.51和11.27個[4,14]。

本研究結果表明，酶解法的卵泡回收量、分離後卵泡培養的殘存率、排卵率均低於機械法(表1，3)，但分離剛結束時的卵泡活率卻高於機械法(表2)。此結果與Demeestere等的報導不符，卻與Carrell等和Park等的報導相似[11?13]。說明酶解法在分離卵泡時對卵泡造成的直接損傷較少，但對卵泡的遠期存活不利。值得注意的是，本研究採用酶解法分離卵泡時，設定了C組即短時酶解法，採用酶解過程中每隔5 min收穫1次卵泡的改變法，而該組的排卵率顯著高於常規的20 min酶解處理組，證明減少酶的作用時間是有價值的。

為了提高分離卵泡的回收量，同時又保障較高的培養殘存率、排卵率和卵泡的生殖潛能，本研究建立了將酶解法和機械法相結合來分離新生小鼠卵巢移植物中腔前卵泡的技術方案。在結合法(D組)中，將卵巢組織塊先在含有膠原蛋白酶和脫氧核糖核酸酶的分離液中37 ℃消化5 min，隨即採用與單純機械法相同的操作手法進行剝離，同時將剝離出的卵泡立即轉移至不含酶的培養液中。此做法利用酶的消化作用使卵泡周圍的結締組織得到一定消化，卵巢組織變得比較鬆散，從而減少機械剝離時對卵泡的牽拉損傷，同時又使游離出的卵泡及時離開分離液，減少了水解酶對卵泡的作用時間，比單純酶解法或單純機械法更有利於保持卵泡的三維結構。實驗結果表明，D組中分離後卵泡的存活率與單純酶解法(B、C組)無差別，但高於單純機械法(A組)，而每塊卵巢的卵泡回收量、平均排卵數、卵母細胞成熟率多項指標均高於其他各組，說明結合法具有絕對優於兩法單用的趨勢。同時，採用結合法從每個卵巢移植塊獲得97.13個卵泡(相當於194卵泡/卵巢)其中40.66%達到排卵，顯著高於國內外文獻所報導的相應數據。值得注意的是，本研究用來源於4種分離方法所培育的卵母細胞進行體外受精，其受精率在各組間並無顯著差異，說明分離技術只對卵泡在後續培養中的發育與成熟有影響，而對那些發育至成熟的卵母細胞的生殖潛能並無顯著影響。

實驗結果提示，本研究建立的酶解?機械結合法是一個良好的卵泡分離技術，對卵巢組織工程的技術進步具有實際套用價值。

[1] Picton H M,Harris S E,Muruvi W, et al. The in vitro growth and maturation of follicles[J]. Reproduction, 2008,136(6):703?715.

[2] Xu M,Banc A,Woodruff T K, et al. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles[J]. Biotechnol Bioeng, 2009,103(2):378?386.

[3] Adriaenssens T,Mazoyer C,Segers I, et al. Differences in collagen expression in cumulus cells after exposure to highly purified menotropin or recombinant follicle?stimulating hormone in a mouse follicle culture mode[J]. Biol Reprod , 2009,21:21.

[4] Shen W,Zhang D,Qing T, et al. Live offspring produced by mouse oocytes derived from premeiotic fetal germ cells[J]. Biol Reprod, 2006,75(4):615?623.

[5] Eppig J J,O`Brien M J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 1996;54:197?207.

[6] Hirao Y, Nagai T, Kubo M, et al. In vitro growth and maturation of pig oocytes[J]. J Reprod Fertil, 1994,100:333?339.

[7] Abir R,Roizman P,Fisch B, et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours[J]. Hum Reprod, 1999,14:1299?1301.

[8] Xu M,Kreeger P K,Shea L D, et al. Tissue?engineered follicles produce live, fertile offspring[J]. Tissue Eng, 2006,12(10):2739?2746.

[9] Hartshorne G M. In vitro culture of ovarian follicles[J]. Rev Reprod, 1997,2:94?104.

[10] Kim J H,Park K S,Song H B, et al. A simple isolating method of preantral follicles from mouse ovaries[J]. Kor J Fertil Steril, 2000,27:235?243.

[11] Demeestere I,Delbaere A,Gervy C, et al. Effect of pre?antral follicle isolation technique on follicular growth, oocyte maturation and fertilization in vitro in the mouse[J]. Hum Reprod, 2000,15(Abst.book 1):89?90.

[12] Carrell D T,Liu L,Huang I, et al. Comparison of maturation, meiotic competence,and chromosome aneuploidy of oocytes derived from two protocols for in vitro culture of mouse secondary follicles[J]. J Assist Reprod Genet, 2005,22(9?10): 347?354.

[13] Park K S,Lee T H,Park Y K, et al. Effects of isolating methods (mechanical or enzymatical) on structure of pre?antral follicles in mouse[J]. J Assist Reprod Genet, 2005,22(9?10):355?359.

[14] Liu J,Van Der Elst J,Van Den Broecke R, et al. Maturation of mouse primordial follicles by combination of grafting and in vitro culture[J]. Biol Reprod, 2000,62:1218?1223.

[15] Eppig J J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals[J]. Reproduction, 2001,122(6):829?838.

[16] Klinger F G,De Felici M. In vitro development of growing oocytes from fetal mouse oocytes: stage?specific regulation by stem cell factor and granulosa cells[J]. Dev Biol, 2002,244(1):85?95.

卵泡發育過程

卵泡發育經過三個過程：募集、選擇和優勢化。一個卵泡從開始發育到最終成熟需約85天。募集過程相當於周期l～4天，其機制可能與卵泡刺激素(FSH)受體數量或卵泡局部微環境的狀態等因素有關。募集對排卵是必要的，但其發生後並不一定有排卵發生。選擇是指在被募集的卵泡簇中有一個卵泡發育為優勢卵泡並具有排卵能力的過程。在周期的5～7天，被選擇的卵泡通過其他卵泡的閉鎖而最後被篩選出來。介於優勢卵泡的選擇和排卵之間的階段則為卵泡的最佳化過程。

1．始基卵泡

直徑0．03～O．06mm，每個卵原細胞具有46條染色體，進行有絲分裂，是由初級卵母細胞和其周圍單層扁平的前體顆粒細胞組成。卵巢皮質內形成的始基卵泡不斷地移向卵巢的髓質，為下個周期的卵泡發育提供來源。

2．初級卵泡和次級卵泡

此時單層上皮細胞轉變為立方形的顆粒細胞，其中含初級卵母細胞，卵泡直徑大於0．06mm。次級卵泡形成後顆粒細胞上出現了以下幾個方面的重要變化：促卵泡素、雌激素和雄激素受體形成，縫隙連線形成，卵泡膜形成。顆粒細胞合成並分泌粘多糖，形成透明帶。

3．竇卵泡

當卵泡直徑達O．2～0．4mm時，顆粒細胞間產生液體，堆積形成腔。

4．成熟卵泡

體積顯著增大，顆粒細胞層內側液體逐漸增多，空腔亦隨著增大，卵細胞移向一側。此時卵泡芳香化酶活性進一步增強，雌二醇分泌達高峰，並可對下丘腦一垂體的周期中樞產生正反饋效應，使促性腺激素釋放劇增，形成排卵前黃體生成激素(LH)峰而促發排卵。其結構從外向內依次為：卵泡外膜、卵泡內膜、顆粒細胞、卵泡腔、卵丘、放射冠。在放射冠與卵細胞之間還有一層很薄的透明帶。在臨近排卵前，卵丘中的顆粒細胞排列疏鬆。成熟型卵一冠一丘複合物的形態特徵是：顆粒細胞展開，細胞之間距離加大，放射冠細胞分散，卵母細胞排出第一極體，此時為MII期卵母細胞。