南京教案又稱南京教難是基督教在中國所遇到的第一次教案，發生在明神宗萬曆四十四年（1616年），事件的發起人是禮部侍郎署南京禮部尚書沈榷。
沈榷在1615年到南京任職。當時，天主教在南京建立了教堂，教務有很大的發展。1616年，沈榷向萬曆帝寫了幾封信，信中極力批判天主教的教義和教徒，認為他們對皇帝和中國的文化都很不尊重。他站在儒家的立場上，提出了種種理由，列舉了一系列證據，完全否定了天主教，甚至說天主教的曆法也破壞了中國人的道德秩序。在華天主教傳教士與白蓮教有染，圖謀不軌，徐光啟上疏辯護不果。
沈榷最初的兩次嘗試並沒有成功，第三次他聯合了皇帝的一位親信和其他幾位高官共同攻擊天主教。一些傳教士如王豐肅、謝務祿（Alvarus de Semedo ，後改名曾德昭）等在南京被逮捕，官方宣布了天主教的一系列罪行，七月十二月龐迪我、熊三拔等人從北京被押解澳門。他們所建立的教堂被拆毀，一些墓地也遭到破壞。這次教案持續了三年的時間，1621年沈官員被撤職，天主教又重新恢復了活動。
這是明朝末年西洋傳教士在華的第一次重大挫折。
背景,經過,評價,
背景
16世紀，歐洲宗教改革運動風起雲湧，猛烈地衝擊著羅馬天主教會在歐洲的統治。面對宗教改革潮流，羅馬教廷也採取了一些自我革新措施，耶穌會就是在這樣的背景下誕生的。為改變天主教在歐洲的困難局面，羅馬教廷派遣耶穌會士前往中國傳教，以擴大天主教的信仰領地及在東方的影響。
在南京教案（1616年）以前，中間也有一些教士被當地人民圍毆、侮辱、住宅被搗亂、被抓坐牢、被驅逐出境等事件發生。但這都僅屬於地方性的事件，影響範圍不大，而且很快就平息了。但南京教難卻不同，這事在利瑪竇死後第六年發生，斷斷續續維持了好幾年，後果是頗為嚴重的。
1619年7月15日，湯若望和他的教友們抵達了澳門，被安置在聖·保祿學院裡。傳教士們一踏上中國土地，便開始精心研習中國語言文化，甚至以掌握北京官話為目標。這些西方修士入鄉隨俗，脫下僧袍，換上儒服，住進中式房屋，並潛心研究中國經史和倫理，尋找其中東西方文化的融合點。在同朝野名流交往的過程中，這些上通天文，下知地理，又熟讀漢文典籍的西方傳教士，自然贏得了中國文人士大夫的好感和信任，從而達到其傳播信仰的目的，這就是利瑪竇開創的“合儒超儒”的傳教策略。但有些狂熱的傳教士們，認為利瑪竇過於遷就中國人，影響了天主教的“純正性”，發展教徒速度太慢。在利瑪竇去世之後，開始改變利氏的傳教路線，採取激進式的傳教方式，堅決排斥儒家思想，嚴禁中國教民祭天、祭祖、拜孔子，激起了社會人士的反感與懷疑，釀成“南京教案”，傳教士們被驅逐，在中國內地幾乎無立足之地。
經過
南京教案的經過是由當時南京的禮部侍郎沈灌發起的，他一向偏愛佛教，對基督教毫無好感，並且帶動一班仇視基督教的人，常常逼迫基督徒。在利瑪竇死後，他便蠢蠢欲動，想起來排除基督教。1616年沈灌連上三張奏書給皇帝明神宗，沈灌告傳教士的罪狀主要有三方面：
一、控告傳教士送禮物給中國人是為了收買人心，以致在適當時候可以傾覆中國。
二、傳教士曾幫助中國修歷，推算日蝕、月蝕等日期。沈灌認為傳教士以西洋方法治歷，違反堯舜一向的做法，是有意變亂中國傳統。
三、沈灌指控傳教士破壞儒家文化，教導人不拜祭祖先，這更是中國人不能容忍的。
但沈灌一再上奏，引起各地民眾排教。朝廷在壓力下，只好下令“禁教”，勒令將傳教士驅逐出境。於是傳教士有些被殺，有些下在監里，日後又驅逐出境。這時傳教士大多撤退到澳門，有些則躲在信徒家中，不能再公開傳福音。在外表上教會活動看似停止了，但暗地裡工作卻未停止。不過這次南京教案，確實帶給了教會一定的損失和限制，數年後，教案就平靜了。明朝最後的一位皇帝崇禎皇帝，因推算日、月蝕的士大夫屢屢出錯，令崇禎十分不滿，於是又準許傳教士進中國，天主教在中國又再度活躍起來了。
明朝被推翻後，滿清入主中國，朝代的改變，並沒有影響天主教在中國的發展。南京教案後七、八十年之間，天主教基本上的發展是很順利的。當時中國十幾個主要省份都建立了教堂，信徒人數達一百二十萬。但就在教會順利發展時，傳教士之間在禮儀問題上，卻產生了很大的爭論，使教會受到很大的影響和打擊。
評價
南京教案是東西方不同的文化價值觀、晚明黨派鬥爭等因素綜合作用的結果 ，成為晚明天主教傳華後發生的第一起影響較大的反天主教事件。
