基本介紹
- 書名：《讓腫瘤自然凋亡》
- 作者：董淮海
- ISBN：978-7-5377-4762-2
- 類別：腫瘤-生物療法
- 頁數：120
- 定價：20.00
- 出版社：山西科學技術出版社
- 出版時間：2014.03
- 裝幀：精裝
- 開本：850×1168
釋義,原義,現義,機理,檢測,形態觀測,實驗分析,
釋義
原義
diāo wánɡ
凋亡
謂大量減少。《陳書·世祖紀》：“自喪亂以來，十有餘載，編戶凋亡，萬不遺一，中原氓庶，蓋雲無幾。”
現義
也稱為“固縮壞死”、“程式性細胞死亡”或“細胞自殺”，是由基因介導的一系列變化，細胞依靠它來主動地引起它自身的破壞。正常起消除老化細胞或未參與免疫反應的淋巴細胞的凋亡過程，如發生病理性干擾，可對腫瘤生成起作用。凋亡最初由特徵性的形態變化來確定，包括：DNA的程式性降解、染色質濃縮、細胞縮小和碎裂。它可以是生理性的，或由化療藥物及放射誘發（來自希臘文，apoptosis，描寫深秋枯葉掉落的現象）。
是存在於細胞中的自毀機制。這個過程機體能清除衰老及異常細胞，並在維持很多細胞功能方面有重要作用。細胞發生變異的癌細胞就是因為關閉了細胞內線粒體的這一調控功能，所以才躲過這一調控機制，不會自我毀滅。
機理
細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：
細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激後胞內一系列控制開關的開啟或關閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同，客觀上說對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識是不全面的，比較清楚的通路主要有：
1）細胞凋亡的膜受體通路
各種外界因素是細胞凋亡的啟動劑，它們可以通過不同的信號傳遞系統傳遞凋亡信號，引起細胞凋亡，我們以Fas -FasL為例：
Fas是一種跨膜蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導受體三聚體化，然後在細胞膜上形成凋亡誘導複合物，這個複合物中包括帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD。Fas又稱CD95，是由325個胺基酸組成的受體分子，Fas一旦和配體FasL結合，可通過Fas分子啟動致死性信號轉導，最終引起細胞一系列特徵性變化，使細胞死亡。Fas作為一種普遍表達的受體分子，可出現於多種細胞表面，但FasL的表達卻有其特點，通常只出現於活化的T細胞和NK細胞，因而已被活化的殺傷性免疫細胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細胞於死地。Fas分子胞內段帶有特殊的死亡結構域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL結合後，使三個Fas分子的死亡結構域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結構域的蛋白FADD。FADD是死亡信號轉錄中的一個連線蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結構域）和N端（DED）部分。DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，該蛋白再以DED連線另一個帶有DED的後續成分，由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發生同嗜性交聯，聚合多個caspase8的分子，caspase8分子逐由單鏈酶原轉成有活性的雙鏈蛋白，進而引起隨後的級聯反應，即Caspases，後者作為酶原而被激活，引起下面的級聯反應。細胞發生凋亡。因而TNF誘導的細胞凋亡途徑與此類似
2）細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學途經
線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心。實驗表明了細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，並促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導因子，如AIF，參與激活caspase。可見，細胞凋亡小體的相關組份存在於正常細胞的不同部位。促凋亡因子能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細胞色素C從線粒體釋放的調節是細胞凋亡分子機理研究的關鍵問題。多數凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途經。有人認為受體介導的凋亡途經也有細胞色素C從線粒體的釋放。如對Fas應答的細胞中，一類細胞（type1）中含有足夠的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受體活化從而導致細胞凋亡。在這類細胞中高表達Bcl-2並不能抑制Fas誘導的細胞凋亡。在另一類細胞（type2）如肝細胞中，Fas受體介導的胱解酶8活化不能達到很高的水平。因此這類細胞中的凋亡信號需要藉助凋亡的線粒體途經來放大，而Bid -- 一種僅含有BH3結構域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。
Caspase
儘管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發現，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特徵：
1)C端同源區存在半胱氨酸激活位點，此激活位點結構域為QACR/QG。
2）通常以酶原的形式存在，相對分子質量29000-49000(29-49KD），在受到激活後其內部保守的天冬氨酸殘基經水解形成大（P20）小（P10）兩個亞單位，並進而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個P20/P10異二聚體可來源於同一前體分子也可來源於兩個不同的前體分子。
3）未端具有一個小的或大的原結構域。
參與誘導凋亡的Caspase分成兩大類：啟動酶（inititaor）和效應酶（effector）它們分別在死亡信號轉導的上游和下游發揮作用。
Caspase的活化
Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然後再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關，一般來說後者是前者的結果，發生同源活化的Caspase又被稱為啟動caspase（initiator caspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導凋亡後，起始Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化複合體，形成同源二聚體構像改變，導致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8,10,2介導死亡受體通路的細胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體複合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細胞凋亡，則被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。同源活化是細胞凋亡過程中最早發生的capases水解活化事件，啟動Caspase活化後，即開啟細胞內的死亡程式，通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號放大，同時將死亡信號向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執行caspase(executioner caspase），包括Caspase-3,-6,-7。執行Caspase不象啟動Caspase ，不能被募集到或結合起始活化複合體，它們必須依賴啟動Caspase才能活化。
效應機制
凋亡細胞的特徵性表現，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最後形成由細胞膜包裹的凋亡小體，然後，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬，這一過程大約經歷30-60分鐘，Caspase引起上述細胞凋亡相關變化的全過程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機制：
1) 凋亡抑制物
正常活細胞因為核酸酶處於無活性狀態，而不出現DNA斷裂，這是由於核酸酶和抑制物結合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化（fragmentation）。現知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因為CAD-ICAD，以一種無活性的複合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產生，有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成並顯示活性，提示CAD-ICAD以一種其轉錄方式存在，因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的。
2) 破壞細胞結構
Caspase可直接破壞細胞結構，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成並進行正常的排列。在細胞發生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮。
3) 調節蛋白喪失功能
Caspase可作用於幾種與細胞骨架調節有關的酶或蛋白，改變細胞結構。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產生片段，使之不能通過肌動蛋白（actin）纖維來調節細胞骨架。
所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進行"破壞"，它們切斷細胞與周圍的聯繫，拆散細胞骨架，阻斷細胞DNA複製和修復，干擾mRNA剪下，損傷DNA與核結構，誘導細胞表達可被其他的細胞吞噬的信號，並進一步使之降解為凋亡小體。
形態變化
生化特徵
檢測
早期
1) PS(磷脂醯絲氨酸）在細胞外膜上的檢測
2）細胞內氧化還原狀態改變的檢測
3）細胞色素C的定位檢測
4) 線粒體膜電位變化的檢測
晚期
對於晚期檢測通常有以下方法：
2) LM-PCR Ladder （連線介導的PCR檢測）
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測）
生化方法
1）典型的生化特徵：DNA 片段化
3)TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）
4）通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或螢光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。
LM-PCR
（連線介導的PCR檢測）
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR，連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA後，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然後進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特徵，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。花開花謝，似水流年……
其它方法
1)Telemerase Detection （端粒酶檢測）
端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重複序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、複製衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。
2)mRNA水平的檢測
研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報導，Fas 蛋白結合受體後能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X （長的） 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用螢光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas,bax-alpha 和 bcl-X （長的） 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。
內氧化還原
C的定位
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）後啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1複合物激活caspase-9，後者再激活caspase-3和其它下游caspase。
電位變化
3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由於線粒體內膜的通透性轉變，這是由於生成了動態的由多個蛋白質組成的位於線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道（PT孔道）能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。
線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據：
1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，並不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。
2）形態學觀察，看到細胞數目有限，統計學上的準確性受影響；
3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例；
用於流式細胞儀檢測的染料：
PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。
PI和Hoechst33342雙標：
PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的螢光染料，故細胞在處於壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡藍色，內有較深的藍色顆粒；而凋亡細胞的核由於濃集而呈亮藍色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。
故PI著色為壞死細胞；亮藍色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為凋亡細胞。
PI和Annexin-V雙標：
Annexin-V（green）可以和磷脂醯絲氨酸（PS）特異性結合。因此細胞處於凋亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性。
形態觀測
1、普通光學顯微鏡觀察
2、透射電子顯微鏡觀察
3、螢光顯微鏡觀察
普通光鏡
倒置顯微鏡
1）細胞體積變小，全面皺縮；
2）凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。
透射電子顯微鏡
凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。
螢光顯微鏡
Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色螢光。
1)PI雙染色法基本原理
DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。
碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
注意事項
實驗分析
細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然後大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和螢光素、過氧化物酶、鹼性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離後，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然後分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特徵，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛採用。
酶的標記
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1%，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去後，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。
試劑配製
2、蛋白酶K(200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩衝液 76μl，混勻，置於冰上備用。
6、洗滌與終止反應緩衝液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml
實驗步驟
1、標本預處理：
⑴石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置於染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug/ml），於室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然後按下述步驟2進行操作。
⑵冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10%中性甲醛中，於室溫固定10min後，去除多餘液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，於-20℃處理5min，去除多餘液體。用PBS洗兩次，每次5min，然後按下述步驟2進行操作。
⑶培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞於 4%中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液並使之乾燥。用PBS洗兩次，每次5min，然後按下述步驟2進行操作。
2、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，於室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多餘液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩衝液，置室溫1～5min。
4、用濾紙小心吸去切片周圍的多餘液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中於37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05%DAB溶液，室溫顯色3～6min。
9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最後1次5min。
11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、乾燥後，在光學顯微鏡下觀察並記錄實驗結果。
注意事項
一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其餘步驟與實驗組相同。
細胞產生不可修復的DNA損傷後通常會程式性死亡，或稱凋亡。然而在腫瘤細胞中這一機制失去作用，所以它能夠肆意增殖，拒絕接受“自殺”的命令。德國科學家發現了其中的可能原因——腫瘤細胞會降解一種能觸發凋亡的蛋白。抑制這種蛋白的降解能夠使凋亡機制恢復作用，並將提升放療和化療的效力。相關論文發表在《自然—細胞生物學》（Nature Cell Biology）上。
嚴重DNA損傷後觸發凋亡的其中一類蛋白是HIPK2分子。德國癌症研究中心的Thomas Hofmann和同事研究發現，HIPK2不斷在健康細胞中產生，但一種名為Siah-1的酶將它標記為“垃圾”，所以它又立刻被降解。
輕微損傷的細胞會進入一種低級警戒狀態——短時間內抑制HIPK2的降解。一旦損傷得到修復，細胞會立即恢復對HIPK2的降解。只有在嚴重損傷（比如DNA雙鏈均遭破壞）的細胞中，HIPK2的降解才被永久性地抑制。結果HIPK2不斷積累，觸發凋亡，細胞自殺。
研究人員推測，這可能就是放療和化療有時失效的原因。這兩種治療方法都會嚴重損傷腫瘤細胞，最終導致它們的程式性死亡。Thomas Hofmann說：“如果有抵抗發生，經常是由於腫瘤細胞‘拒絕’執行自殺的命令。”
