二維聚丙烯醯胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術（根據蛋白質等電點進行分離）以及SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳技術（根據蛋白質的大小進行分離）。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。目前所套用的二維聚丙烯醯胺凝膠電泳體系原理是根據蛋白質的兩個一級屬性，即等電點和相對分子質量的特異性，將蛋白質混合物在電荷（採用等電聚焦方式）和相對分子質量兩個方向上進行分離。
基本介紹
- 中文名：二維聚丙烯醯胺凝膠電泳
- 外文名：2D―PAGE
- 技術：等電聚焦技術
- 原理：蛋白質等電點進行分離
簡介,原理,蛋白質的分離,分離膠的染色,PAM沉澱的技術流程,發展歷史,技術局限性,技術的改進,
簡介
二維聚丙烯醯胺凝膠電泳（2D―PAGE）
二維聚丙烯醯胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術（根據蛋白質等電點進行分離）以及SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳技術（根據蛋白質的大小進行分離）。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。
原理
蛋白質的分離
通常第一維電泳是等電聚焦，在細管中（φ1～3 mm）中加入含有兩性電解質、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯醯胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。而後將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩衝液處理30 min，使SDS與蛋白質充分結合。
將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯醯胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定並與濃縮膠連線。在第二維電泳過程中，結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯醯胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據其分子量大小被分離。
這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質，有些報導可以分辨出5000～10000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近。由於二維電泳具有很高的解析度，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白。
例如將某個蛋白質的mRNA轉入到青蛙的卵母細胞中，通過對轉入和未轉入細胞的提取液的二維電泳圖譜的比較，轉入mRNA的細胞提取液的二維電泳圖譜中應存在一個特殊的蛋白質斑點，這樣就可以直接檢測mRNA的翻譯結果。二維電泳是一項很需要技術並且很辛苦的工作。目前已有一些計算機控制的系統可以直接記錄並比較複雜的二維電泳圖譜。
目前所套用的二維聚丙烯醯胺凝膠電泳體系原理是根據蛋白質的兩個一級屬性，即等電點和相對分子質量的特異性，將蛋白質混合物在電荷(採用等電聚焦方式)和相對分子質量兩個方向上進行分離。
蛋白質混合物在第一維方向上的分離是利用蛋白質等電點的不同在大孔凝膠中將蛋白質分離開，這一過程被稱作等電聚焦。蛋白質是兩性分子，根據環境PH值的不同分別帶正電、負電或零電荷，在ph高於具等電點的位置時，蛋白質帶負電，反之帶正電。在電場作用下，蛋白質分子會分別向正極或負極漂移，當達到與其等電點相同的ph位置時，蛋白質不帶電，就不在發生漂移。根據此原理，開始的等電聚焦在凝膠中預先由小分子載體兩性電解質形成ph梯度。
載體兩性電解質是一些可溶性的兩性小分子，它們在其PI附近有很高的緩衝能力。當電壓加在載體兩性電解質混合物之間時，最高PI值的分子(帶正電荷最多的分子)移向陰極，最低 PI值的分子(帶負電荷最多的分子)移向陽極，其餘分子將根據其PI值在兩個極值之間分散，形成一個連續的ph梯度；當蛋白質遷移與其等電點相同的ph值位置時，帶電狀態達到平衡，不再遷移，結果等電點不同的蛋白質分了得到分離。蛋白質帶電狀念取決於其二級結構，因此，沒有完全去除二級結構的蛋白質，就可能會產生連續分布的帶電狀態各異的同一蛋白質的各種構象，從而在2一DE膠上產生條紋現象而降低解析度。因此，要達到最好的解析度，蛋白質必須充分變性，如在9mol/L尿素和7mol/L二硫蘇糖醇(DTT)條件下變性。
蛋白質混合物存第二維方向上的分離是按照蛋白質的相對分子質量的大小進行分離。蛋白質是帶電的生物大分子，在第二維方向按其相對分子質量分離時，為了消除電荷的干擾，需要採用SDS對蛋白質進行變性處理。我們在2一DE譜上所看到的是不完整的蛋白質亞基分子，而SDS是一種強離子去污劑，作為變性劑與助溶性試劑，可以斷裂分子內與分子間的氫鍵或其他非共價鍵，使分子變性，破壞蛋白質分子的二級結構與三級結構；同時，強還原試劑巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑後，蛋白質分子被解聚成它的多肽鏈。解聚後的胺基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質一SDS膠束，所帶的電荷大大超過了蛋白質分了原有的電荷，這就消除了不同分子之間原有的電荷差異。因此這種膠束在SDS-PAGE中的電泳遷移率不受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決於蛋白質或亞基的大小。
分離膠的染色
二維聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後的蛋白質點經顯色後才能被鑑定。二維聚丙烯醯胺凝膠電泳中的顯色是一個重要的步驟，常用的非放射性染色方法中最靈敏的為銀染法，其靈敏度可達到l ng甚罕更低；其次是螢光染色以及銅染、鋅咪唑負性染色、考馬斯亮藍染色等，後者染色靈敏度為50-100ng。由於銀染凝膠的質譜鑑定較難，附著在凝膠基質上的肽片段膠內提取效率較低，因此，大多實驗室用銀染尋找差異蛋白質點，再加大上樣量，進行考馬斯亮藍染色，結合膠內酶切提取鑑定蛋白質。
PAM沉澱的技術流程
PAM沉澱的技術流程
沉澱是發生化學反應時生成了不溶於反應物所在溶液的物質。從字意上理解就是在重力作用下沉澱去除。污水中的懸浮物質，可以這是一種物理過程，簡便易行，效果良好，是污水處理的重要技術之一。
根據懸浮物質的性質、濃度及絮聚丙烯醯胺凝性能，沉澱可以分為：自然沉澱，絮凝沉澱，區域沉澱。域沉澱的懸浮顆泣濃度較高(5000mg/L以上)，顆粒的沉降受到周圍其它顆粒影響，顆粒間相對位置保持不變，形成一個整體共同下沉，與澄清水之間有清晰的泥水界面。二次沉澱池與污泥濃縮池中均有區域沉澱發生。
廢水中懸浮固體濃度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉澱過程中，固體顆粒不改變形狀，也不互相粘合，各自獨立地完成沉澱過程。（沉砂池和初沉池的初期沉澱）壓縮沉澱發生在高濃度懸浮顆粒的沉降過程中，由於懸浮顆粒濃度很高，顆粒相互之間已擠集成團塊結構，互相接觸，互相支承，下層顆粒間的水在上層顆粒的重力作用下被擠出，使污泥得到濃縮。二沉池污泥斗中的聚丙烯醯胺濃縮過程以及在濃縮池中污泥的濃縮過程存在壓縮沉澱。自由沉澱發生在水中懸浮固體濃度不高，沉澱過程懸浮固體之間互不干擾，顆粒各自單獨進行沉澱，顆粒的沉澱軌跡呈直線。整個沉澱過程中，顆粒的物理性質，如形狀，大小及比重等不發生變化。這種顆粒在沉砂池中的沉澱是自由沉澱。
廢水中懸浮固體濃度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉澱過程中，固體顆粒不改變形狀，也不互相粘合，各自獨立地完成沉澱過程。（沉砂池和初沉池的初期沉澱）壓縮沉澱發生在高濃度懸浮顆粒的沉降過程中，由於懸浮顆粒濃度很高，顆粒相互之間已擠集成團塊結構，互相接觸，互相支承，下層顆粒間的水在上層顆粒的重力作用下被擠出，使污泥得到濃縮。二沉池污泥斗中的濃縮過程以及在濃縮池中污泥的濃縮過程存在壓縮聚丙烯醯胺沉澱。
絮凝沉澱是顆粒物在水中作絮凝沉澱的過程。在水中投加混凝劑後，其中懸浮物的膠體及分散顆粒在分子力的相互作用下生成絮狀體且在沉降過程中它們互相碰撞凝聚，其尺寸和質量不斷變大，沉速不斷增加。懸浮物的去除率不但取決於沉澱速度，而且與沉澱深度有關。地面水中投加混凝劑後形成的礬花，生活污水中的有機懸浮物，活性污泥在沉澱過程中都會出現絮凝沉澱的現象。
用途
1)用於污泥脫水根據污泥性質可選用本產品的相應型號，可有效在污泥進入壓濾之前進行污泥脫水，脫水時，產生絮團大，不粘濾布，壓濾時不散，流泥餅較厚，脫水效率高，泥餅含水率在80%以下。
2)用於生活污水和有機廢水的處理，本產品在配性或鹼性介質中均呈現陽電性，這樣對污水中懸浮顆粒帶陰電荷的污水進行絮凝沉澱，澄清很有效。如生產糧食酒精廢水，造紙廢水，城市污水處理廠的廢水，啤酒廢水，味素廠廢水，製糖廢水，有機含量高 廢水、飼料廢水，紡織印染廢水等，用陽離子聚丙烯醯胺要比用陰離子、非離子聚丙烯醯胺或無機鹽類效果要高數倍或數十倍，因為這類廢水普遍帶陰電荷。
3)用於以江河水作水源的自來水的處理絮凝劑，用量少，效果好，成本低，特別是和無機絮凝劑複合使用效果更好，它將成為治長江、黃河及其它流域的自來水廠的高效絮凝劑。
5)用於油田經學助劑，如粘土防膨劑，油田酸化用稠化劑。
6)用於紡織上漿劑、漿液性能穩定、落漿少、織物斷頭率低、布面光潔。
發展歷史
根據一維等電聚焦方式的不同，可將二維聚丙烯醯胺凝膠電泳分為3種系統。第一種系統是在聚丙烯醯胺管膠中進行，兩性電解質在外加電場作用下形成梯度，這一系統被稱為ISO-DALT系統。 ISO-DALT系統的主要缺點是ph梯度不穩定(如陰極漂移)、重複性差、上樣量低，固不利於不同實驗室之間進行圖譜的比較和數據發布。但通過最佳化各種電泳條件，仍可得到相對穩定的圖譜。針對鹼性蛋白質難以分離的問題，後米引入了非平衡DH梯度電泳，該體系主要在鹼性蛋白質的分離上提高了性能，但重複性仍比較差。如果在第一維方向上的電泳使用丙烯醯胺和不同PH的丙烯醯胺的衍生物共聚，從而建立起具有ph梯度的固相化膠條，這樣的系統稱為固相pH梯度等電聚焦系統。IPG—IEF已成為目前通用的一維等電聚焦方式。
IPG膠條的使用大大提高了二維聚丙烯醯胺凝膠電泳的重複性和解析度，從而使二維聚丙烯醯胺凝膠電泳數據的發布和圖譜的比較成為可能。在較好的狀態下，傳統等電聚焦技術和變性(採用十二烷基硫酸鈉)聚丙烯醯胺凝膠電泳在20cm左右長度的凝膠中可在各自方向上分辨出100個不同的蛋白質條帶，因此，理論上二維聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨能力可達到l0000個點。目前已有實驗室在30cm×40cm的大膠上獲得這一分離效果；考慮到大多數實驗室並不具備運行這種大膠所需要的條件，普通情況下的凝膠(20 cm×20 cm) 分辨到3000個點己是相當不錯，而儀酵母菌的全蛋白質組就有6000多個蛋白質，已完成的人類基因組估計有3萬～5萬個基因，可能表達的蛋白質達數十萬，這些將對2一DE技術的分離能力提出挑戰。
技術局限性
大規模的基因組測序技術的問世使人類基因組計畫的最終目標得以提前實現。目前所面臨的技術挑戰是如何分析基因組計畫己獲得的大量序列信息並加於運用。基因的生物學功能不能只通過對核酸的序列檢測來實現，而需要通過對其表達產物—— 蛋白質的結構與功能的研究束進行判定。2-DE的優勢是它可以更直觀地提供這些表達產物的相對分子質量、等電點、表達豐度的相對量等信息，但它又不可能完全呈現出你所需要關注的蛋白質，一些問題依然是該技術所無法克服的，如低豐度蛋白質點的檢測，極酸性和極鹼性區蛋白質的分離，高分子質量區蛋白質的分離，疏水性膜蛋白的分離提取。另外，還有2-DE的自動化操作也是一個期待解決的難點。雖然目前已經有能夠同時運行10塊與20塊膠的垂直電泳槽問世，但2-DE仍是一個高強度、難以自動化的蛋白質組分離技術。
