1970年，Ⅱ型限制性核酸內切酶由Smith等首先在流感嗜血桿菌的Rd型菌株中發現。目前已有幾百種I類限制性核酸內切酶被分離，且其數量仍在不斷增加。Ⅱ型限制性核酸內切酶是一類分子質量較小的單體蛋白，識別和切割雙鏈DNA分子時僅需要Mg2+存在即可。II型限制酶能夠特異性識別四核苷酸或六核苷酸的旋轉對稱(又稱回文方式)核酸序列，並在識別區內特定的核苷酸處內切DNA雙鏈中的磷酸二酯鍵，產生確定的限制片段和跑膠條帶，因此Ⅱ型限制酶是三類限制性核酸內切酶中最常用於DNA分析和克隆的一類，故通常所指的限制性核酸內切酶都是Ⅱ型限制酶。
Ⅱ型限制酶中最普遍的是像HhaI、HindI和NotI這樣在識別序列中間進行切割的酶，這一類I型限制酶是構成商業化限制酶的主要部分。大部分這類酶都以同型二聚體的形式結合到DNA上，因而識別的都是對稱序列;但有少數此類酶以單聚體的形式結合到DNA.上，識別非對稱序列。一些II型限制酶識別連續的序列(如EcoRI識別GAATTC),而另--些識別不連續的序列(如BglI識別GCCNNNNNGGC)。另一種比較常見的II型限制酶是所謂的IS型酶，比如FokI和AloI。它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，為400~650個胺基酸;它們識別連續的非對稱序列，有一個結合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認為這類酶主要以單體的形式結合到DNA上，但與臨近的酶結合成二聚體，協同切開DNA鏈。因此，IS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時活力可能更高。第三種Ⅱ型限制性核酸內切酶(有時也被稱為IV型限制性核酸內切酶)是一類較大的、集限制和修飾功能於一體的酶，通常由850~1250個鹼基組成，在同一.條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續序列，並在識別位點的一端切開DNA鏈，而另一些酶識別不連續的序列(如BegI識別CGANNNNNNTGC)，並在識別位點的兩端切開DNA鏈，產生一小段含識別序列的片段。此類酶的胺基酸序列各不相同，但其結構組成是一致的，它們在N端有一一個負責切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連線;此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構成C端，或以獨立的亞基形式存在。當此類酶與底物結合時，它們或行使限制性核酸內切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。II型限制性核酸內切酶被廣泛地套用於基因工程，是分解和重建DNA等基因工程操作中的基本工具。本章中將著重介紹I型限制酶的特點和作用。
