bFGFMAb

鹼性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 是由Gospodarowiz等1於1974年在牛腦垂體中發現的，因對3T3細胞有強烈的促增殖和有絲分裂作用，且等電點為9.6而得名。此次發現展開了對成纖維細胞生長因子的鑑定，純化及測序等研究的序幕。用於抗腫瘤治療的抗bFGF單克隆抗體還沒有上市。但是很多公司卻生產用於實驗室研究的單抗。

基本介紹

• 中文名：鹼性成纖維細胞生長因子
• 外文名：bFGFMAb
• 發現人：Gospodarowiz
• 發現時間：1974年

歷史沿革

早在1987年就有Massoglia等人首次製備了抗bFGF單抗，但他們製備的單抗無一對腫瘤生長有抑制作用。bFGF在哺乳動物體內已發現的23種FGFs[2]中被命名為FGF-2，與aFGF同屬FGF-1亞家族。bFGF有18、22、22.5、24、34kd等5種亞型，低分子量 (18kd) bFGF定位於細胞質，而高分子量形式則定位於細胞核中[3]。bFGF在促進血管新生、細胞分裂及生長等方面有強烈的生物活性。bFGF分布極其廣泛，高表達於一些惡性腫瘤，其與腫瘤病理分級、分期呈正相關，近來研究表明它成為了一些腫瘤的標誌物，一直是研究熱點[4]。對此針對bFGF的抗體研究引起了國內外學者極大的興趣，bFGF抗體通過抑制bFGF活性及其下游信號傳遞，可產生明顯的抗腫瘤效果。本文主要就bFGF (18kd) 單克隆抗體的製備、性質、套用、抑瘤機制、研究前景等進行綜述。

bFGF單克隆抗體對於重組bFGF的表達、純化和鑑定，體液中bFGF的定量檢測和組織定位提供了有力的手段，為研究bFGF與腫瘤發生、發展機制的關係與開展對腫瘤的診斷提供了重要基礎；日益備受重視的bFGF全人基因工程抗體具有抗體藥物的研究開發前景。

識別表位

抗體對其抗原表位的識別關係到抗體中和活性。成熟bFGF含有146個胺基酸，是由155個胺基酸的前肽脫去N端1-9胺基酸所形成[15]。人源性和牛源性bFGF僅有2個胺基酸的差別，其抗原表位研究一直吸引著人們。對抗體的研究表明，抗體活性與其識別bFGF的表位非常相關。Massoglia等[5]進行了抗體識別表位研究的首次嘗試，他們製備的單抗McAbs 42識別缺少1-15肽段的bFGF分子；McAbs 6、8、38三種單抗的識別表位則位於完全抗原氨基端的10個殘基內。Seno等[6]合成bFGF的N端1-9肽，同時用大腸桿菌表達重組bFGF (13-40) 肽段，通過肽段與bFGF分子的競爭實驗，確定了Mab12和78識別位點位於1-9肽段內，Mab52和98的識別位點位於13-40肽段內。上述單抗都不能中和bFGF的體內外生物活性。Matsuzaki等[8]研究發現中和性單抗bFM-1不識別Tyr16bFGF (1-15) ，Tyr51bFGF (36-50) ，Tyr132bFGF (133-146) 這幾個線性片段，說明bFM-1識別bFGF空間表位，而無中和性的bFM-2識別線性表位。另外，Anouma[11]發現識別bFGF肝素結合表位的單抗2G11體外能抑制腫瘤細胞生長但無體內抗腫瘤作用；而不與肝素競爭結合的單抗1E6卻表現出非常強的體內外抗腫瘤作用。他們研究還表明具有體內抗腫瘤作用的bFM-1和3H3單抗與bFGF的結合都不受肝素的影響。這些結果顯示識別bFGF受體結合表位的抗體能中和bFGF的生物學活性。目前，隨著bFGF的線性序列、空間構象、受體 (FGFR) 以及結合肝素位點等的確定[16]，中和性單抗識別表位的研究可更進一步。圖1所示為FGF-19中和性單抗的識別位點圖[17]。藍色和粉紅色區域所示FGFR4，綠色和黃色區域表示兩分子FGF-19，橘紅色區域是FGF-19中和性單抗的識別位點。由於FGF/FGFR的結合方式一定，所以參考FGF-19單抗的研究可以確定FGF-2中和性單抗的識別表位。

克隆抗體

bFGF抗體的製備集中在20世紀80年代末到90年代，bFGF單克隆抗體研究則始於1987年，美國加州大學Massoglia等[5]首次製備出4株bFGF單克隆抗體，之後日本Takeda公司[6]也製備了4株bFGF單抗並申報了專利（專利號United States Patent 5478740、5981197），但無一抗體能抑制bFGF的促細胞生長活性。

1989年Reilly等[7]製備出4株bFGF單抗，其中DE6與aFGF有交叉反應，DG2是第一種具有體內外中和bFGF活性的單抗。同年Matsuzaki等[8]從192株雜交瘤細胞中篩選出2株分泌bFGF 單抗的細胞株，所分泌抗體分別被命名為bFM-1和bFM-2，均能特異識別牛源性、人源性、鼠源性bFGF，與aFGF無交叉反應。體外實驗發現上述兩種單抗均能抑制牛血管內皮細胞 (BCE) 生長，在0.1-10ug/ml之間呈濃度依賴性，bFM-1作用強於bFM-2。1991年Akira Hori等[9]則首次報導中和性bFGF單抗 (3H3) 能在特定的條件下抑制體內bFGF單獨依賴型腫瘤的生長，不過所用的免疫原bFGF的第70和88位絲氨酸被半胱氨酸取代。1999年Anouma等[10]製備了3株bFGF單抗，發現2G11和1E6能體外中和bFGF活性，並分析了肝素對單抗生物活性的影響，認識到識別受體結合位點的單抗具有體內外抑瘤活性。國內bFGF單克隆抗體研究始於1998年，向軍儉等[11]製備的抗牛bFGF單抗能體外中和bFGF促3T3細胞增殖的活性，2008年又報導所製備的抗重組人bFGF的單克隆抗體能誘導黑色素瘤細胞B16凋亡[14]。以上報導的絕大多數bFGF單抗屬於IgG1，IgM類的單抗報導較少[12]。

抗體套用

3.1 bFGF的定量檢測

1989年Sato等[18]用bFGF多抗作為包被抗體，利用bFGF與肝素特異結合的性質，以酶標肝素為檢測抗體，建立了第一個多抗-肝素bFGF夾心酶標檢測法，最低檢測量可到達3pg/100μl。1991年Watanabe等[19]建立了第一個實用性的bFGF單克隆抗體夾心法，方法中套用Mab52和Mab98兩種單抗混合作為包被抗體，辣根過氧化物酶標記的3H3的Fab片段作為檢測抗體，靈敏度可達10pg/ml，對血清的檢測靈敏度可達30pg/ml。Masayuki等[20]改進了Watanabe的方法，通過改變酶反應底物使靈敏度提高了10倍，對血清的檢測靈敏度達到3pg/ml。R&D systems公司即在此基礎上開發出bFGF酶聯檢測試劑盒。Gabra等[21]又改進了Watanabe的方法，使用抗牛bFGF的兩種單抗作為包被抗體，兔抗人bFGF多抗作為檢測抗體，使得靈敏度可達1pg/100μl。這些方法的建立為bFGF微量檢測提供了強有力的工具。國內向軍儉等[22]建立的bFGF間接、競爭ELISA方法，靈敏度分別為10和1.0pg/孔。劉士德等[13]使用自製抗牛bFGF單抗建立的bFGF雙抗體夾心法最低檢測量達20μg/L，與商品化試劑盒（3pg/ml）差距比較大。

3.2 bFGF的定位標記

Takahashi等[23]使用鼠源性單抗Mab78對神經膠質瘤細胞和腦膜瘤分泌的bFGF進行免疫組化定位，發現bFGF大量分泌在這些腫瘤中。提示bFGF抗體可成為揭示bFGF與腫瘤相關性研究的有力工具之一，目前得到廣泛套用。

3.3 bFGF生物學活性研究

Ernst等[24]在胃潰瘍小鼠模型上發現，使用bFGF單抗能延緩潰瘍的癒合，減少新生血管的數量，該發現進一步佐證了bFGF促血管新生的功能。Naoya Emoto等[25]發現針對合成短bFGF多肽氨基端 (1-24) 片段的抗血清能濃度依賴性的促進bFGF在小鼠甲狀腺葉狀細胞系FRTL-5的作用。Tao等[26]發現bFGF單抗能體內外抑制小神經膠質細胞的分裂。這些研究證明了 bFGF的促有絲分裂、促血管新生的生物學功能。提示bFGF抗體在研究bFGF生物學活性方面具有潛在價值。

3.4抑制腫瘤生長的研究

bFGF與腫瘤的密切相關性已有許多正面研究報導[4; 27]，大量有關bFGF抗體與腫瘤的研究業已證實。早在1989年就已發現bFGF單抗DG2能高度抑制體外培養的幼倉鼠腎臟內皮細胞對bFGF引起的血管新生應答[7]。Emoto等[28]也發現bFGF抗體能抑制腎癌細胞的生長。Nemati等[29]套用抗bFGF免疫療法，發現bFGF抗體在無胸腺裸鼠模型中能抑制血管新生和惡性神經膠質瘤的生長。Takahashi JA[30], Gross JL[31], Stan AC[32]等也分別發現bFGF單抗能體內外抑制神經膠質瘤的生長。Murai等[33]還發現bFGF中和性單抗 (3H3) 能體內外誘導人腦膠質瘤細胞凋亡，為神經膠質瘤提供了一種有前途的治療方法。但具體凋亡指數，凋亡機制有待進一步的研究。研究者發現bFGF和FGFR在膠質瘤細胞中高表達，而對照組的肺癌A431細胞卻無表達[30]，大量研究顯示與bFGF最為密切相關的是人腦神經膠質瘤。另外Ogasawara等[34]人分析了肝癌細胞bFGF和FGFR的分泌量，還發現單抗3H3能顯著抑制肝癌細胞系及其體內移植瘤的生長，證明bFGF與肝癌的相關性。

隨著研究的不斷深入，學者們分析了不同腫瘤細胞的bFGF、FGFR表達量，bFGF抗體對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用、實體瘤抑制作用等，並觀察了多種抗體聯合使用時抑制腫瘤的協同作用。Brieger[35]等研究了bFGF抗體和抗血管內皮細胞生長因子（Vascular Endothelial Growht Factor, VEGF）抗體對鱗狀上皮癌細胞對輻射抗性的作用，發現抗bFGF和VEGF抗體能有效減少放射處理後細胞集落的形成，加入bFGF抗體可使鱗狀上皮癌細胞防輻射作用降低20%。Coppola G[36]等製備出bFGF單抗DG2，採用三種注射方法給藥，發現當給藥方式為腫瘤內部注射時單抗能顯著抑制小鼠軟骨肉瘤的生長及血管新生，而靜脈注射和腹腔注射則無上述作用。作者提出需對單抗體內動力學參數，有效給藥方式等做進一步的研究。Rofstad等[37]研究了抗bFGF、VEGF、白介素-8（IL-8）和血小板衍化內皮細胞生長因子（Platelet-derived endothelial cell growth factor, PDGF）抗體對四株鼠移植黑色素瘤細胞系 (A-07、D-12、R-18和U-25) 的生長抑制作用，首次報導了bFGF抗體和PDGF抗體能抑制移植黑色素瘤的生長，血管形成和轉移。提示bFGF抗體與其他生長因子的抗體存在協同作用。國內向軍儉等[14]發現bFGF單抗能體外抑制小鼠黑色素瘤B16 細胞的增殖，並誘導其凋亡，機制有待進一步的研究。林衛等[38; 39]研究發現Santa Cruz商品化bFGF單抗能明顯抑制卵巢癌細胞的增殖，卵巢癌的生長和血管新生，並呈濃度依賴性。謝慶祥等[40]通過建立裸鼠皮下移植膀胱癌動物模型進行研究，發現Sigma的bFGF單抗治療組皮下瘤體積和重量比對照組均顯著減少，瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）指數和微血管密度（MVD）也顯著降低，表明bFGF單抗對膀胱癌的生長具有明顯抑制作用。其主要通過抑制膀胱癌細胞增殖和減少腫瘤血管形成而在荷瘤裸鼠體內發揮抗腫瘤作用。

以上研究結果表明包括鱗狀上皮癌、人腦膠質瘤、軟骨肉瘤、黑色素瘤、腎癌[7, 35]、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等癌細胞都對bFGF抗體敏感，其增殖分別受到不同程度的抑制，其中膠質瘤U87和U251細胞系在bFGF抗體單獨作用下還能發生凋亡，顯示出bFGF與腫瘤的密切相關性，而且bFGF單抗有望成為腫瘤生物治療的新方法。但國內目前尚未開發出具有顯著體內抑瘤作用的bFGF單抗，隨著bFGF及其抗體研究的進一步深入，將為一些疾病的預防和治療提供新的途徑和方向。

4 bFGF單克隆抗體抑制腫瘤生長的作用機制

各類研究顯示，bFGF單抗抑瘤作用機制主要有兩種：1、直接抑制高分泌bFGF/FGFR的腫瘤細胞生長[29; 30]，或誘導細胞凋亡[14; 33]；對於少量分泌bFGF的腫瘤細胞作用比較小[34]。分泌bFM-1單抗的雜交瘤細胞注射到無胸腺的小鼠背部能致瘤，雖然小鼠血液中抗體活性很高，但無抑制實體瘤生長的作用，間接表明單抗對分泌bFGF的靶細胞起作用，而對bFGF分泌呈陰性的細胞無非特異細胞毒作用[8]，本室也發現類似現象。表明單抗對於受bFGF旁分泌和自分泌機制調控的腫瘤細胞才有效[30; 31]，對於bFGF內分泌型細胞無作用[41]。2、通過抑制bFGF誘導的血管新生從而間接地抑制腫瘤的生長[9; 31]。VEGF 單克隆抗體發揮作用不是針對血管內皮細胞本身，而是中和VEGF與其受體的結合[42]，bFGF與 VEGF同為膜分泌型生長因子，其機制是否類似於VEGF單抗？目前人們對bFGF的信號通路比較清楚，那么抗bFGF 中和性單抗抑瘤的分子機制究竟是阻斷bFGF與其受體的結合起阻斷和中和作用，是被內化入細胞直接起殺傷作用[43]，還是影響了FGFR受體酪氨酸激酶的活性引起下游信號通路發生改變，這些都需進一步的研究。其中可對bFGF/FGFR下游接頭蛋白（Shb）和纖維細胞生長因子受體底物2（FRS2），以及細胞外調節蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) 和促分裂素原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 的磷酸化水平的變化情況進行研究[17; 44]。

5 bFGF抗體藥物研究展望

20多年來bFGF抗體經歷了多克隆抗體、單克隆抗體、bFGF片段抗體、人源化抗體的發展階段。目前bFGF單抗已成功商品化，中和性單抗有FB8 (Sigma公司)，bFM-1 (Millipore公司) 和3H3 (Calbiochem公司)。Santa cruz公司生產的許多抗體，是使用bFGF片段作為免疫原而製備的，同樣具有廣泛的套用功能。但是相比2004年被FDA批准上市的VEGF單克隆抗體Bevacizumab[45]來說，目前的商品化bFGF單抗卻局限於實驗室研究，其臨床研究仍未見報導。原因可能有：1、bFGF只在某些惡性腫瘤中高表達、與某些腫瘤呈高相關性。因此針對bFGF高分泌型腫瘤時抗bFGF單抗的治療才有效[9]，否則無效[46]，提示中和性抗體抑制血管新生和腫瘤生長的效果會因腫瘤的不同而出現較大差異，且腫瘤細胞需同時高表達bFGF及其受體，單抗才會有抑瘤作用；2、一些研究[47]表明bFGF單抗在阻斷bFGF信號通路時，可致VEGF上調；另外bFGF與PDGF-BB也有協同作用[48]，阻斷bFGF的信號通路時可激活PDGF-BB信號通路，從而不能抑制腫瘤生長。當然腫瘤受bFGF與其他多種細胞生長因子的網路調節較為複雜，它們促腫瘤生長作用的主次關係是bFGF單抗成為抗腫瘤藥物的關鍵。

本文認為bFGF單抗的研究在以下方面仍值得完善：1、單抗識別表位的研究，最近報導的識別FGF-19和FGF-8b空間表位的單抗具有中和性與抗腫瘤功能[17; 44]，該研究為抗bFGF單抗的識別表位研究提供了新的方向；2、單抗引起的細胞信號通路變化，多種抗膜分泌型因子的單抗均能誘導細胞凋亡[33; 49; 50]，其機制的深入研究可能會給抗bFGF單抗的抗腫瘤研究帶來新的思路；3、高親和力bFGF單抗的製備及人源化研究[33]，該類研究可有效減少HAMA反應因而顯得非常重要，目前本室正在開展此工作[51]。

bFGF單抗能在體內外有效地抑制自分泌或旁分泌bFGF依賴性腫瘤的生長，具有腫瘤生物治療藥物的開發前景[45]，進一步研究其抑瘤機制，以及其與多種腫瘤相關因子抗體的協同抑瘤作用，是bFGF單抗用於腫瘤治療的研究策略之一[52; 53]。