P14-3-3對脅迫應答因子PSti-1的調控作用

《P14-3-3對脅迫應答因子PSti-1的調控作用》是依託深圳大學，由劉士德擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：P14-3-3對脅迫應答因子PSti-1的調控作用
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：劉士德
• 依託單位：深圳大學

項目摘要

14-3-3蛋白是細胞脅迫應答的關鍵調控因子，前人關於該蛋白在脅迫應答中的作用研究主要集中在該蛋白調控轉錄因子激活脅迫應答基因轉錄上，很少關注該蛋白在非轉錄途徑對其它脅迫應答因子（如Sti-1）的調控作用。我們在前期研究中，從多頭絨泡菌分離出多個與P14-3-3相關的脅迫應答蛋白，其中，PSti-1（Sti-1同源蛋白）具有提高大腸桿菌抗鹽和抗滲透壓脅迫的作用。本項目擬在前期研究基礎上，通過Real-Time PCR和confocal檢測脅迫作用對P14-3-3、PSti-1和PNTase（中性海藻糖酶同源蛋白）表達定位的影響，通過酵母雙雜交和 Fret技術檢測P14-3-3與PSti-1和PNTase的相互作用關係；以PNTase作為脅迫效應蛋白，在酵母細胞內單表達、雙表達和三表達P14-3-3、PSti-1和PNTase，以檢測P14-3-3對PSti-1脅迫應答功能的調控作用。

結題摘要

多頭絨泡菌的原質團是多核體細胞，只有細胞核和線粒體兩種細胞器；但具有多細胞生物的耐脅迫能力，是研究細胞脅迫應答的好材料；也是研究細胞氧化與線粒體關係的好材料。為了解環境脅迫對多頭絨泡菌的影響，我們檢測了山梨醇、Cu2+、Cr3+和納米TiO2對多頭絨泡菌原質團生長的影響，發現低劑量上述脅迫可刺激多頭絨泡菌生長，但超過臨界劑量後都會抑制多頭絨泡菌生長。我們還發現，納米TiO2抑制多頭絨泡菌生長時的ROS水平和GST表達水平高於刺激生長時的ROS水平和GST表達水平，而多頭絨泡菌14-3-3、Sti-1和HSP70蛋白（P14-3-3、PSti-1和PHsp70）的表達只與應激有關，與納米TiO2的脅迫劑量無關，說明上述3個蛋白都是脅迫應答蛋白。保守的14-3-3和Sti-1是兩個與脅迫應答有關分子伴侶蛋白，但尚未看到兩個蛋白相互配合調控脅迫應答的報導。本研究通過Q-PCR檢測發現P14-3-3、PSti-1和actin的表達既受細胞周期調控，也受孢子形成調控。通過檢測共表達的相互作用蛋白能激活酵母Y187報告基因LacZ的表達發現，P14-3-3與PSti-1、PHsp70、actin和GST間存在相互作用。Bmh1和Bmh2是酵母的兩個14-3-3蛋白，其基因分別稱作rad24和rad25。本研究發現，Bmh1與Sti-1間存在相互作用，但Bmh2與Sti-1間沒有直接作用。利用酵母Y258，我們製備了基因rad24、rad25和sti1單缺失以及基因rad24/sti1和rad25/sti1雙缺失的酵母，製備了sti1和psti1補救的酵母以及Bmh1、Bmh1和P14-3-3過表達的酵母，發現缺失sti1的酵母耐受高溫、H2O2、NaCl和山梨醇脅迫的能力顯著下降，補救sti1和psti1能恢復酵母的耐脅迫能力；缺失rad24或rad25可提高酵母的耐高溫和H2O2脅迫的能力，但過表達Bmh1、Bmh1和P14-3-3對酵母的影響卻與之相反；雙缺失rad24/sti1會降低酵母耐受高溫、H2O2和山梨醇脅迫的能力，但雙缺失rad25/sti1卻能提高酵母耐受高溫、H2O2和山梨醇脅迫的能力。本研究還發現PHsp70和actin是P14-3-3和PSti-1共同作用的配體蛋白。此外，本研究還製備了3個P14-3-3的單克隆抗體。