DNA連線反應

利用DNA連線酶把載體DNA和要克隆的目的DNA片段連線在一起，成為一個完整的重組分子，這就是分子克隆中常說的連線反應。當載體DNA和外源DNA末端都是由一種產生粘性末端的內切酶切割產生的話（同尾酶也可以），或者兩者末端被接上一段互補的多聚體的尾巴，那么經退火後可形成新的重組分子。連線後產生的重組分子中仍然保留著外源DNA兩端的限制性內切酶切點，從而使我們能方便地從重組分子再次取出所克隆的DNA段。

DNA連線介紹

DNA片段的連線在基因操作過程中套用廣泛。通常情況下利用T4DNALigase必須經過長達16小時才能完成連線反應,而且反應常常受到DNA末端結構等的影響。寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的DNA連線系統(TaKaRaDNALigationKitVer.2)由於其獨特的反應液體系,可以將反應時間縮短至半個小時,且不受DNA結構等的影響,大大地節省了反應時間,方便了實驗操作。此外,在使用本試劑盒時,由於只需簡單地向DNA溶液中加入一種溶液,可以在極小的反應體積下,短時間內高效地完成各種形式的DNA連線。並且反應液可以直接用於感受態細胞的轉化和體外包裝等。

實驗方法

1、試劑盒內容(50次量)

SolutionI(酶溶液)250μl×3;SolutionⅡ(緩衝液)750μl×1。

2、向pUC118-EcoRI分解物中插入DNA片段(環狀DNA的連線)

含有pUC118/EcoRIFragment(50ng)及1.5KbpEcoRIFragment(2.5～250ngg)的DNA溶液共5μl，加入等量的SolutionI溶液(5μl)，混合均勻後在16℃下反應30分鐘，取反應液的一部分轉化至JM109感受態細胞後在含有X-Gal、IPTG及Amp的L-瓊脂平板培養基上塗板生長，形成單菌落，計數白色菌落。同時以通常使用T4DNALigase(350U)，在16℃下進行16小時的連線反應作對照。在本實驗中所使用的JM109感受態細胞的轉化效率為6.3×107Colonies/μgpUC18DNA。結果表明,使用DNALigationKitVer.2時的連線效率比使用T4DNALigase時的連線效率高。

3、向噬菌體臂λgt11/EcoRI中插入pBR322/EcoRI分解物(線形DNA的連線)

含噬菌體臂λgt11/EcoRI(脫磷酸化)250ng及pBR322/EcoRI25ng的DNA溶液共5μl,加入與DNA等量的SolutionⅡ(5μl),均勻混合。然後加入DNA溶液2倍量的SolutionI(10μl)，在26℃下反應10分鐘。取20μl反應液中的4μl,使用λDNAinVitroPackingKit進行體外包裝,形成噬菌體粒子，並以此感染EcoliY1090(r-)形成透明噬菌斑。同時以T4DNALigase(350U),在26℃的連線反應作對照。結果同樣表明,使用DNALigationKitVer.2時的連線效率比使用T4DNALigase時的連線效率高。