《高核酸背景下的DNA預擴增及檢測技術》是依託中國海洋大學，由梁興國擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：高核酸背景下的DNA預擴增及檢測技術
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：梁興國
- 依託單位：中國海洋大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
核酸檢測是醫療、食品、衛生等領域的關鍵技術，而實際樣品檢測中很難解決高靈敏度與高特異性的矛盾，易產生誤判。特別是對於食品或病體組織中病菌病毒含量極低的情況，因大量背景核酸的干擾，檢測靈敏度降低，假陽性頻發。目前主要採用螢光定量PCR法解決檢測精確度不足的問題，但對樣品要求嚴格，結果仍不穩定。本項目將進行逆向思維，在預擴增中有效利用大量的背景核酸來提高擴增的靈敏度；然後進行特異性擴增，解決特異性和靈敏度不能共同提高的矛盾。同時，利用上述原理對滾環擴增進行根本上的改進，實現常溫檢測，達到簡便、經濟、準確等實用要求。本方法的特點是分兩步進行，預擴增中利用酶切後部分背景核酸與靶DNA具有同樣粘性末端的性質，使擴增靈敏度提高數百倍以上；特異性擴增中採用比較溫和的條件達到高特異性。本項目將研究理論模型建立、序列設計、檢測效果評價等內容，為高核酸背景下的核酸檢測提供技術基礎。
結題摘要
核酸擴增在生物工程、食品、醫療、衛生等多個領域有著廣泛的套用，是生命科學及其套用領域的關鍵技術。而實際樣品檢測中很難同時提高靈敏度與特異性，往往顧此失彼，易於產生誤判。雖然螢光定量PCR法可部分解決檢測精確度不足的問題，但對樣品要求嚴格，高靈敏檢測的結果也不穩定。例如，在食品或病體組織中病菌病毒含量極低的情況下，因大量背景核酸的干擾，檢測靈敏度降低，假陽性頻發。本項目針對這一問題，採用逆向思維，提出了將特異性和靈敏度分步進行的基本理論，並將其套用於聚合酶鏈式擴增（PCR）和滾環擴增（RCA），同時提高了靈敏度和特異性，且大大減少了二者的相互制約；將開發的技術套用於實際樣品，實證了該理論具有廣泛的套用前景，易於推廣使用。項目的關鍵成果是，通過採用IIS型限制性內切酶，使包含Target在內的很多酶切片段都含有5-9鹼基長的特定序列，這樣連線接頭（線性或成環）後進行PCR或RCA擴增，可以提高靈敏度100-1000倍以上；這樣可以大大減輕後續特異性擴增的壓力，在不產生非特異性擴增的條件下進行擴增，使準確率接近100%。同時，採用RCA可在恆溫條件下擴增，並直接肉眼觀測擴增結果，不必使用可快速變溫的PCR儀。另外，在解決DNA高效特異性連線及環化等問題中，取得了以下重要成果：1、實現了DNA的高效環化，解決了DNA環化過程中易產生多聚副產物的問題，並成功製備出了穩定的左螺旋DNA，共發表SCI論文10篇（包括IF＞10論文3篇）；2、開發了採用高解析度熔點測定法（HRM）高通量測定短鏈DNA熔點的方法，並用於分析DNA二級結構和定量分析DNA連線酶的動力學特性等；3、發現了DNA模板的二級結構形成會顯著影響PCR等方法的擴增效率，需要在引物設計時予以充分考慮；4、將核酸擴增技術用於大量製備DNA並用作納米材料等。本項目共發表論文33篇（SCI論文26篇），其中以本項目為第一標註項目號的SCI論文24篇，中文論文5篇。本項目的基礎理論成果和開發的技術在核酸研究領域具有非常廣闊的套用前景。
