變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人於20 世紀80 年代初期發明的，起初主要用來檢測DNA 片段中的點突變。Muyzer 等人在1993 年首次將其套用於微生物群落結構研究 。後來又發展出其衍生技術，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此後十年間，該技術被廣泛用於微生物分子生態學研究的各個領域，目前已經發展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。

基本介紹

• 中文名：變性梯度凝膠電泳
• 外文名：denatured gradient gel electrophoresis
• 發明時期：20 世紀80 年代
• 發明人：Lerman 等人

原理

雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯醯胺凝膠電泳時，其遷移行為決定於其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。DGGE/TGGE 技術在一般的聚丙烯醯胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲醯胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區分開來。一個特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區域(meltingdomain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個幾百個鹼基對的DNA 片段一般有幾個解鏈區域，每個解鏈區域有一段連續的鹼基對組成（圖1）。當變性劑濃度逐漸增加達到其最低的解鏈區域濃度時，該區域這一段連續的鹼基對發生解鏈。當濃度度再升高依次達到各其他解鏈區域濃度時，這些區域也依次發生解鏈。直到變性劑濃度達到最高的解鏈區域濃度後，最高的解鏈區域也發生解鏈，從而雙鏈DNA 完全解鏈。

不同的雙鏈DNA 片段

不同的雙鏈DNA 片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區域及各解鏈區域的解鏈濃度也是不一樣的。當它們進行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域解鏈，此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯醯胺凝膠中一樣。然而，一旦變性劑濃度達到DNA 片段最高的解鏈區域溫度時，DNA 片段會完全解鏈，成為單鏈DNA 分子，此時它們又能在膠中繼續遷移。因此如果不同DNA 片段的序列差異發生在最高的解鏈區域時，這些片段就不能被區分開來。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個鹼基對）可以解決這個問題。含有GC 夾子的DNA 片段最高的解鏈區域在GC 夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當加了GC 夾子後，DNA 片段中基本上每個鹼基處的序列差異都能被區分開。然而一旦DNA 片段遷移到一特定位置，其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域解鏈時，雙鏈DNA 片段最低的解鏈區域立即發生解鏈。部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA 片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區域的解鏈濃度，因此它們會在膠中的不同位置處發生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區分開來。

特點

DGGE/TGGE已廣泛用於分析自然環境中細菌、藍細菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性[8]。這一技術能夠提供群落中優勢種類信息並同時分析多個樣品，具有可重複和操作簡單等特點, 適合於調查種群的時空變化, 並且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑑定群落組成。DGGE和TGGE分別通過逐漸增加的化學變性劑線性濃度梯度和線性溫度梯度可以把長度相同但只有一個鹼基不同的DNA片段分離。DNA分子的雙鏈在特定溫度下會分離，這個溫度取決於互補鏈的氫鍵含量（富含GC的區域融解溫度較高）和相鄰鹼基的引力。

DGGE 法的優缺點

優點

1、幾乎可以檢出所有突變

2、可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用於進一步的分析

3、無須標記

4、電泳前只需一步操作

5、可用於未經擴增的基因組 DNA

6、可檢測出象甲基化這樣的 DNA 修飾

缺點

1、需要專門設備需要用計算機對序列進行分析

2、需要進行預實驗需要昂貴的“ GC 夾板”

3、無法確定突變在 DNA 片段中位置

4、需要用含有毒性物質甲醯胺的梯度凝膠

5、DNA 片段大小限制在 100-500bp