蜜蜂抗菌肽

蜜蜂體內的抗菌肽主要是受到微生物或其他外源物質的侵染時產生的apidaecin、abaecin、bee defensin和hymenoptaecin等，同時王漿腺產生oyalisin和其他抗菌小肽，以及毒腺中的主要毒蛋白melittin等具有抗菌作用蛋白質肽類的總稱。

基本介紹

• 中文名：蜜蜂抗菌肽
• 外文名：無
• 類別：蛋白質
• 範疇：免疫

簡介

昆蟲在受到微生物或其他外源物質的浸染時，血淋巴會產生相當數量的抗菌蛋白或抗菌肽，這些肽類物質主要是由脂肪體合成後分泌到血淋巴中，是一種十分有效的防禦機制，可用來迅速殺死或清除外源的微生物。

原理

不同於動物的免疫應答，昆蟲沒有嚴格意義上的免疫應答機制，昆蟲血淋巴所產生的這些抗菌肽可以由一種微生物入侵產生，沒有特異性，誘導產物不是只對特定的入侵微生物產生的，通常對其他微生物也有抗生作用。一般具有對熱穩定，抗酸鹼和活性離子濃度範圍廣等特點。儘管如此，血淋巴內的不同的抗菌肽在具體的抗菌作用方面還是表現出一定的差異，有些對革蘭氏陰性菌起作用，有些對革蘭氏陽性菌起作用，有些則是對真菌有較強的殺傷作用。血淋巴內的這些不同的抗菌肽相互補償，共同抵抗外源微生物的侵染；抗菌肽按其化學構成、抗菌範圍以及抗菌機制的不同主要可分為五大類：1 溶菌酶型；2 短鏈（20－40胺基酸殘基）α螺旋型，與膜的離子通透性有關；3 分子內二硫鍵型，抗菌過程涉及到膜的破壞；4 富含精氨酸/脯氨酸型（Arg-Pro-Rich）和長的多功能域型（Long multi-domain），一般序列較長（大於70個胺基酸殘基），苷氨酸的含量較高，有特定的功能域，與其他的四類抗菌蛋白沒有序列或模體（Motif）上的相似性。

蜜蜂在受到大腸桿菌感染後，血淋巴內會產生幾種抗菌肽，主要有apidaecin、abaecin、bee defensin和hymenoptaecin，這幾種肽類物質具有不同的分子量，化學組成和結構就有不同的特點，相應的在抗菌的機制和作用上也有所不同。

價值

由於部分抗菌肽對與人類健康相關的一些微生物具有很強的生物活性，具有很大的套用潛力。因此，在這方面也進行了許多工作；另外，蜜蜂毒液中也含有的一些毒蛋白，如melittin等也具有明顯的抑菌作用，蜂王漿中近些年來也分離出有兩種具有抗菌作用的多肽（royalisin和另一種小肽）。

1 蜜蜂血淋巴中的抗菌肽

1.1 apidaecin

apidaecin是一種含有18個胺基酸殘基的小肽，富含脯氨酸，感染微生物的蜜蜂體內的apidaecin是由許多異構物組成，主要對革蘭氏陰性菌起作用，最低抑菌濃度在10-8－10-6M之間。

膜翅目昆蟲的apidaecin類型的肽類物質在序列上大致可分為保守區（與一般的抗菌作用有關）和可變區（與特異性的抗菌作用有關），可變區胺基酸殘基的改變有可能導致所抗菌株的改變，而保守區序列的改變則常導致抗菌作用的減弱和喪失。

編碼apidaecin的基因轉錄成的前體mRNA是由Prepro－Sequence（編碼16個胺基酸的信號肽序列）、Pro－Sequence（編碼16個胺基酸的前序列）、數量不等地由幾乎相同的84個核甘酸組成的重複單元（一般為1－12個）以及此C－末端序列而成，每個單元由一個編碼成熟的apidaecin的序列和編碼6－8個胺基酸以及一個二肽序列RR（N－末端的第一個單元的二肽是兩個精氨酸AA）組成。

apidaecin的成熟過程主要有以下幾個步驟，首先，翻譯的蛋白在相關酶類的作用下去除信號肽，餘下的包含成熟的apidaecin串連單元在內切蛋白酶（endoproteae）的作用下，在二肽的C－末端切開，切開的二肽在carboxypeptidase “Kex2”的作用下進一步降解。餘下的間隔序列和成熟肽部分由氨基二肽酶（dipeptidyl aminopeptidase）每次從N－末端移去兩個胺基酸，直至最終形成成熟的apidaecin。

不同於其他的抗菌肽形成孔道破壞膜的通透性，apidaecin不形成孔道，主要是涉及一種定向的選擇機制進行的。通過研究apidaecin的不同變異形式及構型對革蘭氏陰性菌的抑菌作用，人們發現apidaecin的作用是有手性的，也即有方向性的，只有L－構型的apidaecin具有抑菌作用，而D－構型的儘管能進入細胞內，但並不表現出抑菌作用；不同的變異類型對抑菌作用的影響大小不同，在所謂的保守區的很小變化，就會導致抗菌性能的完全喪失，而在可變區的變異則導致對原來菌株作用的喪失，但又會對一個新的菌株有作用，即決定不同菌株的抗性；抑菌作用的大小與進入細胞的apidaecin分子的多少有關，L－脯氨酸對於apidaecin進入細胞有競爭作用。apidaecin分子進入細胞是一個消耗能量的過程，並且是不可逆轉的。通過膜的機制可能涉及膜上的轉運蛋白，但轉運蛋白並不是apidaecin作用的終點，很可能進入細胞內後再與靶標分子作用，影響細胞內的一些重要代謝過程，從現有的資料來看，這一過程很可能涉及蛋白合成過程。為進一步利用apidaecin，在apidaecin的分泌型表達和不同的變異型的抗菌性能檢測方面做了有益的探索。

apidaecin的這種多組分存在的現象，一般只有兩種解釋，一是存在多等位基因，一是來自於一個多基因家族。而apidaecin在序列上是高度一致的，但其轉錄產物的長度是多變的，所包含的重複單位數量不等，差異很大，這點很難由等位基因理論來解釋。為了解apidaecin基因的組織方式，以5’－和3’－非編碼區序列作引物，以基因組DNA為模板，進行PCR反應，獲得的不同長度的產物都能夠同apidaecin的編碼序列雜交，說明存在不同的apidaecin基因。為闡明這些基因在染色體上是分散的還是聚集在一體的，提取基因組DNA，用Hind III酶切，然後作Southern雜交，證實這些基因位於一個15kb的酶切片斷上，該片斷進一步用EcorI 酶切成兩個5.1和6.4Kb的片斷，分別用5’－和3’－非編碼區序列作探針進行Southern雜交，也都有信號產生。這一組試驗說明，編碼apidaecin的基因是以族聚的形式分布於染色體上的。基因的這種分布形式，至少有兩方面的益處，一是可以有冗餘的基因進行變異，以利於物種的存活繁衍；另一方面就是基因產物在量上的效應，可以在短時間內表達大量的產物，行使相應的生物功能。

1.2 bee defensin

bee defensin 則是在免疫誘導的蜜蜂血淋巴內分離發現的，該成分在免疫誘導的蜜蜂血淋巴內含量極少，比其他三種誘導肽類少20－50倍。在序列組成上與royalisin幾乎相同，也是由51個胺基酸殘基組成，僅在第50位的胺基酸殘基不同，有bee defensin中的精氨酸代替royalisin中的酪氨酸。同樣對革蘭氏陽性菌有作用；通過編碼Bee defensin的cDNA克隆的分析，在C－末端應該還有一個甘氨酸，而在成熟肽中則沒有這一殘基，據此，人們認為bee defensin的C－末端是醯胺化的，C—末端的甘氨酸提供－NH2，這種醯胺化的修飾作用對於穩定分子的雙螺旋結構進而保障分子的溶菌活性是非常重要的。bee defensin 前體結構是由19個胺基酸組成的信號肽序列、22個胺基酸組成的前序列以及51個胺基酸組成的成熟序列組成。

1.3 hymenoptaecin

hymenoptaecin是由93個胺基酸殘基組成的陽離子型多肽，與所有已知的抗菌肽不同，其N－末端有一個2－吡咯酮－5－羧酸，在生理條件下，能夠抑制革蘭氏陰性菌和少數革蘭氏陰性菌的生長，最低抑菌濃度較其他抗菌肽要低。同時，不同於其他抑菌肽在離子濃度增加時抑菌效果降低的特性，hymenoptaecin的抑菌效果並不隨溶液中離子強度的增加而減少。其前體結構則是由17個胺基酸組成的信號肽序列、17個胺基酸組成的前序列以及93個胺基酸組成的成熟肽組成。

hymenoptaecin的抑菌作用主要涉及對細菌膜通透性的影響。利用大腸桿菌細胞內的β－半乳糖苷酶基因，在培養液中加入一定濃度的誘導劑IPTG，表達該基因，然後在培養液內加入生色底物ONPG，連續跟蹤測試溶液的吸光值，可以反應出該底物進入細胞的速度，可以從一個方面反映細胞膜的通透性。利用此原理，可以測得hymenoptaecin對細胞膜的通透性有破壞作用。Tween 20可以加速這一進程，Tween 20和其他的一些去垢劑能夠融解細胞內膜的一些組成蛋白，通過融解作用破壞內膜，進而對細胞造成破壞。而單獨的Tween 20 不能通過細胞外膜，在hymenoptaecin的作用下，Tween 20可以進入細胞外膜，連同hymenoptaecin一起，直接對內膜起作用，從而加速對細胞內膜的破壞，膜的通透性和膜電勢的正常狀態是細胞正常功能得以維繫的重要條件，許多重要的生化反應都在細胞膜上進行，如呼吸作用的進行和ATP的合成等，由於hymenoptaecin對於厭氧菌和好氧菌的作用是一樣的，因此對於氧化磷酸化的影響至少不是第一位的。由此，有觀點認為是膜的正常的動態運輸功能被破壞了，但具體是否是這一點擬還是涉及其他的重要功能還需進一步的試驗證實。但有一點可以確定，hymenoptaecin影響了細胞的一些十分重要功能，從而表現出較強的抑菌作用。

1.4 abaecin

abaecin含有34個胺基酸殘基，其中包括10個脯氨酸殘基，氨基末端序列與apidaecin相似，但比apidaecin 有更廣譜的抗革蘭氏陰性菌的作用，對植物來源的革蘭氏陰性菌的抑菌活性更低。abaecin的前體由19個胺基酸組成的信號肽和34個胺基酸組成的成熟肽組成，沒有Pro－sequence序列，因此它的加工成熟過程非常簡單，只需將信號肽除去即可。意味著它在分泌完成後就是一個成熟的分子了。

不同於apidaecin的多基因族聚分布形式，bee denfensin、abaecin和hymenopaecin三者經Northern雜交分析表明均只有一個轉錄本。

蜜蜂體內的這幾種經誘導產生的抗菌肽，defensin的轉錄水平較低，在膜翅目之外的其他種昆蟲體內也有報導。另外的三者抗菌肽只在膜翅目昆蟲體記憶體在，轉錄的水平較高；其中，apidaecin的轉錄比較容易被激活，輕度的感染就可誘發該基因的轉錄和表達，通常基因表達量也很高，感染後很快就會表達，對許多革蘭氏陰性菌起作用。這可能與蜜蜂在自然條件下的所接觸感染的是植物來源的革蘭氏陰性菌相關，這些病原菌對apidaecin也十分敏感；作為這一機制的補充，hymenopaecin主要是對apidaecin產生抗性的部分革蘭氏陰性菌起作用；apaecin 的抗菌作用比較弱，似乎是作為一種備份機制，主要對apidaecin產生抗性的菌株起作用。hymenopaecin和apaecin的轉錄和翻譯需較強的誘導刺激，表達的量較少，在時相上也比較遲；相比之下，bee defensin 的表達量最少，是蜜蜂血淋巴內唯一的只對抗革蘭氏陽性菌有作用的肽類。因此，蜜蜂體內的這幾種抗菌肽的抑菌作用不是相互重疊的，而是互補的，共同抵禦各種微生物的入侵。

上面幾種抗菌肽主要是以西方蜜蜂為材料所得到的結果。胡義鐮等利用中華蜜蜂研究作材料，用大腸桿菌免疫，研究發現了兩種具有抑菌作用的抗菌肽。一種分子量為11kD，另一種小於5kD，兩者均有較強的耐高溫，耐酸鹼。

2 王漿中的抗菌肽

royalisin是在蜂王漿中發現的一種抗菌肽，是由51個胺基酸殘基組成，分子內有三個二硫鍵，分子量為5523Da，是一種雙親型的蛋白，C－末端序列富含帶電的胺基酸殘基。相應的抑菌試驗證實該蛋白對革蘭氏陽性菌有很強的抑菌作用，在低至1μM的濃度下有效地起作用。另外，royalisin也有抗真菌的作用。

除royalisin之外，在蜂王漿中利用分子篩柱層析的方法分離得到了一種富含甘氨酸（甘氨酸占33%）的小肽，含有8種胺基酸，分子量為2.3kD，抑菌試驗證實對革蘭氏陽性菌有作用。

蜂王漿中的這些抗菌肽和王漿中的10－羥基－葵烯酸的抗菌作用對於正常生存和發育具有重要的意義，蜂王漿是由蜜蜂的王漿腺和上顎腺分泌的，並經專門的分泌管與口道相連，這些抗菌肽與哺乳動物消化道內發現的抗菌肽的作用是相似的，防止直接與外界接觸的組織器官感染；另外，我們知道，新孵化的蜜蜂幼蟲，無論是工蜂、蜂王還是雄蜂，早期階段都是以王漿為食的，這些抗菌物質的存在，對於它們的存活是非常有意義的。另外，有報導說明蜂王漿中存在有一個55kD的蛋白，對於細胞的增殖和發育有促進作用，royalisin的分子量與該蛋白相近，是否屬於相同或相近的物質以及是否還有其他方面的功能，還需進一步的研究。

3 蜂毒中的抗菌肽

蜂毒肽（melittin）是蜂毒中的主要成分，約占蜂毒乾重的50%，具有抗菌、消炎、抗關節炎等作用，僅幾年的研究發現蜂毒肽在抗腫瘤，抗輻射方面也有獨特的作用。蜂毒肽前體的結構由三部分組成，N－末端的21個胺基酸組成的信號肽，接著22個胺基酸的pro-sequence序列，再後面是26個胺基酸的成熟肽。目前關於蜂毒中抗菌肽的報導基本都是關於蜂毒肽的，由於蜂毒肽具有極強的溶血作用，在對其抗菌性能的利用上就有很大的限制。因此，如何提高蜂毒肽的抗菌作用而抑制溶血作用就變得非常重要。

蜂毒肽的抗菌作用主要是C－末端的序列的作用，合成的C－末端15個殘基多肽溶血性能降低了300倍，而抗菌作用只降低5－7倍。進一步研究發現，若將C－末端的兩個帶正電荷殘基移向N－末端，則抗菌活性與蜂毒肽相差無幾，而溶血活性與前者相仿。為研究抗菌肽結構與功能的關係以及提高蜂毒肽的抗菌作用，人們將其他抗菌肽的部分序列與蜂毒肽的C－末端序列構建雜和序列，也表現出抗菌活性。人工合成的缺失α－螺旋的蜂毒肽的非對眏異構體，其溶血作用消失但抗菌作用完全保持。手性對於抗菌作用並不是必須的，D－構型的蜂毒肽和L－構型的蜂毒肽的抗菌作用沒有差別。環形的蜂毒肽比線形的蜂毒肽有更強的抑菌活性和更低的溶血活性。

雖然有關蜜蜂抗菌肽的研究，許多問題目前我們還沒有辦法全部明了，但隨著研究的進一步深入，它們的分子特徵、作用機制等問題肯定會全部為人們掌握，現階段有企業已開始利用現代生物學的技術和手段，體外人工生產蜜蜂抗菌活性肽，並終將以更成熟的產品造福於人類。

參考文獻：

[1] Casteels P, Romagnolo J, Castle M, Casteels-Josson K, Erdjument Bromage H, Tempst P. Biodiversity of apidaecin-type peptide antibiotics. Prospects of manipulating the antibacterial spectrum and combating acquired resistance. Journal of Biological Chemistry. 1994, 269(42): 26107-26115.

[2] Casteels P, Ampe C, Jacobs F, Tempst P. Functional and chemical characterization of Hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera). The Journal of Biological Chemistry (USA), 1993, 268(10): 7044-7054.

[3] Casteels P., Ampe C, Jacobs F, et al. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybee. EMBO J, 1989, 8: 2387-2391.

[4] Casteels P, Tempst P. Apidaecin-type peptide antibiotics function through a non-poreforming mechanism involving stereo specificity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994, 199(1): 339-345.

[5] Castle M, Nazarian A, Tempst P. Lethal effects of apidaecin on Escherichia coli involve sequential molecular interactions with diverse targets. J Biol Chem, 1999, 274 (46): 32555-32564.

[6] Maeno M, Taguchi S, Momose H. Production of antibacterial peptide 'apidaecin' using the secretory expression system of Streptomyces. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1993, 57(7): 1206-1207.

[7] Taguchi S, Ozaki A; Nakagawa K, Momose H. Functional mapping of amino acid residues responsible for the antibacterial action of apidaecin. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(12): 4652-4655.

[8] Casteels-Josson K, Capaci T, Casteels P, Tempst P. Apidaecin multipeptide precursor structure: a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response. EMBO Journal, 1993, 12(4): 1569-1578.

[9] Casteels-Josson K, Zhang W, Capaci T, Casteels P, Tempst P. Acute transcriptional response of the honeybee peptide-antibiotics gene repertoire and required post-translational conversion of the precursor structures. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(46): 28569-28575.

[10] Casteels P, Ampe C, Riviere L, Damme J van, Elicone C, Fleming M, Jacobs F, Tempst P. Isolation and characterization of abaecin, a major antibacterial response peptide in the honeybee (Apis mellifera).European Journal of Biochemistry, 1990, 187: 381-386.

[11] 胡義鐮, 陳衛良, 陳學新等.大腸桿菌誘導中華蜜蜂血淋巴產生抗菌物質的分離分析. 浙江農業大學學報, 1999, 25(3): 307-310.

[12] Fujiwara S, Imai J, Fujiwara M, Yaeshima T, Kawashima T, Kobayashi K. A potent antibacterial protein in royal jelly. Purification and determination of the primary structure of royalisin. J Biol Chem, 1990, 265(19): 11333-11337.

[13]Bilikova K,Wu G,Simuth J. Isolation of a peptide fraction from honeybee royal jelly as a potential antifoulbrood factor. Apidologie, 2001, 32 (3): 275-283.

[14] 肖靜偉, 王戎疆, 李紹文等. 蜂王漿中的一種有抗菌活性的小肽. 昆蟲學報, 1996, 39(2): 133-140.

[15] Lee, J.Y., Boman A., Sun C. et al. Antibacterial-peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecropin. PNAS, 1989, 86(9): 9159-9162.

[16] Kamakura M, Suenobu N, Fukushima M. Fifty-seven-kDa protein in royal jelly enhances proliferation of primary cultured rat hepatocytes and increases albumin production in the absence of serum. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282(4): 865-874.

[17] Subbalakshmi C, Nagaraj R, Sitaram N. ical activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin: design of an analog with improved antibacterial activity. EBS-Letters, 1999, 448(1): 62-66.

[18] Andreu D, Ubach J, Boman A, Wahlin B, Wade D, Merrifield-RB, Boman-HG. Shortened cecropin A-melittin hybrids. Significant size reduction retains potent antibiotic activity. FEBS-Letters, 1992, 296(2): 190-194.

[19] Oh D, Shin SY, Kang J H, Hahm K S, Kim K L, Kim Y. NMR structural characterization of cecropin A (1-8)-magainin 2 (1-12) and cecropin A (1-8)-melittin (1-12) hybrid peptides. Journal of Peptide Research, 1999, 53(5): 578-589.

[20] Boman H G, Wade D, Bowman I A, Wahlin B, Merrifield R B. Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids. FEBS-Letters, 1989, 259(1): 103-106.

[21] Oren Z, Shai Y. Selective lysis of bacteria but not mammalian cells by diastereomers of melittin: structure-function study. Biochemistry Washington, 1997, 36(7): 1826-1835.

[22] Merrifield R B, Juvvadi P, Andreu D, Ubach J, Boman A, Boman H G. Retro and retroenantio analogs of cecropin-melittin hybrids. PNAS, 1995, 92(8): 3449-3453.

[23] Wade D. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides. PNAS, 1990, 87: 4761-4765.

[24] Unger T, Oren Z, Shai Y. The effect of cyclization of magainin 2 and melittin analogues on structure function, and model membrane interactions: implication to their mode of action. Biochemistry, 2001, 40(21): 6388-6397.

Several Antibacterial Active Peptides from Honeybee

Li JianghongChen Dafu

(College of Bee Science, Fujian Agriculture & Forestry Universiry, Fuzhou, 350002)

Abstract:Antibacterial peptides in honeybee includes apidaecin, abaecin, bee defensin, and hymenoptaecin produced by the contaminated bee lymph by microorganism or other exor substance. In this paper, the molecular character, antibacterial spectrum, expression of the antibacterial gene and the mechanism of antibacterial are mainly discussed. At the same time, the royalisin and others small peptides in royal jelly and melittin in honeybee venom are also involved.

Keywords:honeybee; antibacterial peptides; melittin; royalisin

引自

《來自於蜜蜂的幾種抗菌活性肽》

李江紅陳大福
福建農林大學蜂學學院