蛋白質藥動學

蛋白質藥動學就是研究蛋白質或蛋白質藥物等在動物或人體內的吸收、分布、排泄和代謝規律的一門學科。

基本介紹

• 中文名：蛋白質藥動學
• 性質：一門學科
• 分析方法：生物檢定法等
• 研究內容：研究蛋白質或蛋白質藥物等

研究方法

蛋白多肽類藥物的分析方法

1.1　生物檢定法

由於蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於藥物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類藥物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中藥物濃度及鑑定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。

1.1.1　在體分析　常規的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法，如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。

1.1.2　離體組織（細胞）分析　如NGF刺激雞背根神經節增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays）,快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect reduction assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的藥物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直 接計數法和間接計數法，後者包括MTT法，同位素（3H,14C）摻入法 等。此外，還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3]，結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來，細胞培養法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其 不足也顯 而易見。首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態；其次 ，樣品多存在於人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應，影響了方法的專屬性；再者，啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ；依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。

1.2　免疫學方法

免疫學方法是利用蛋白多肽藥物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢藥物 ，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。

1.2.1　放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）　該法是被測藥物（Ag ）,標記藥物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結合反應，方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記藥 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易於控制的優點。

1.2.2　免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）　該法中 被測藥物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag複合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。

1.2.3　酶聯免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）　ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上 述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重複性好，無輻射源的優點，並且已有不少實驗證明 ，它與生物檢定法具有一定的量效關係[4]及相關性[5]，提示它可部分地 反映藥物的生物活性。

免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同時測定代謝 物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差；不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別；還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適於 批處理的方法，已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足藥物動力學研究的商品藥盒。目前臨床 藥動學領域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。

1.3　同位素標記示蹤法

放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記製備簡單 而最為常用。標記方法有兩種，一是內標法，即把含有同位素的胺基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由於製備複雜而限制了其廣泛套用；二是外標法 ，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連線於大分子上，因相對簡單而被首 選。

同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用於蛋白多肽藥物的組織分布研究，但其 缺點亦顯而易見。首先，它不能進行人體藥物動力學研究；其次，同位素標記後是否會引起 藥物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議．前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上可使生物活性無明顯變化；後者因藥而異則複雜 的多，已有報導認為[6]，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導致 其體內清除的紊亂；最後，由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝，或與其它蛋白質結合，總 的放射性不能代表藥物動力學過程，因此如何鑑別樣品的原藥，降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題，目前常用的方法有兩種。

1.3.1　SDS-PAGE法　根據藥物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 藥與其它產物分開，然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中，從而使結果可能偏高。

1.3.2　HPLC法　高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）[7]，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵，Mr大小，極性的 關係 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高，解析度好，可同時測定原藥和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息，而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現性都受影響，且設備昂貴，成本較高。

1.4　色譜法

1.4.1　HPLC　在進行普通藥物動力學研究中，HPLC是技術成熟，套用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽藥物的實驗研究或產業化中，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽藥物結 構的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶螢光檢測 器的HPLC進行藥動學研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 藥動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用，還有許多與免疫學方法的聯用，如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外，令人矚目的還有液 /質線上聯用（LC-MS）。

LC-MS將高分離能力，適用範圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是接口問題，由傳送帶接口（Moving-belt interface），熱噴 霧 接口（Thermospray），到最近的電噴霧離子化接口（Electrosptay ionization ESI），聯 用技術日趨成熟，尤其適用於生物樣品中低濃度（pg/ml）藥物及代謝物的測定[12] ，而蛋 白多肽類藥物恰有在體內代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類藥物，藥物代 謝 物[13，14]的動力學研究，國內尚處於起步階段，除了儀器本身價格昂 貴，技術上亦存在 一些問題，如它對樣品的純度要求很高如何將藥物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾；如何選擇合適的內標以減少系統誤差；在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現，糖肽難用於質譜分析，因為在質譜條件下，同樣的胺基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號，這就大大降低了質譜 信號的專屬性。目前，儘管LC-MS在蛋白多肽藥物的體內藥物代謝動力學研究中還存在一 定的難度，但其作為實用性強，前景好的領域已引起人們的廣泛關注。

1.4.2　高效毛細管電泳（HPCE）　HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力，在毛細管中按其 濃度和分配係數不同進行高效，快速分離的新技術，它以高解析度，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有：蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變，這可以通過塗層CE加以改善；由於毛細管很細，管內容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重複性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 近年來，國外根據樣品的性質採用不同的預處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢，況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性，已有人在藥物動力學研究、體內分析中，將微 透析連續採樣與之聯用[16]，這在整個藥動學研究中都不失為一有希望的方向。 2　結　語

結論

由以上可知，現代科學技術的發展給蛋白多肽類藥物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒於 該類藥物的特殊性，目前尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用藥物註冊國 際協調會議（ICH）對生物藥物臨床前安全性評價“在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理”的總則，人們通常將幾種方法聯合套用，互相補充，才能得到比較可靠的結果。生物技術藥物藥動學 多糖藥動學 多肽藥動學 蛋白質藥動學實驗室