藥物遺傳毒性研究技術指導原則

藥物遺傳毒性研究技術指導原則是2007年10月發布實行的政策參考。

基本信息

【發布單位】國家食品藥品監督管理局
【發布文號】國食藥監注[2007]643號
【發布日期】2007-10-23
【生效日期】2007-10-23
【失效日期】
【所屬類別】政策參考
【檔案來源】國家食品藥品監督管理局

藥物遺傳毒性研究技術指導原則
(國食藥監注[2007]643號)

詳細內容

國家食品藥品監督管理局二○○七年十月二十三日藥物遺傳毒性研究技術指導原則一、概述遺傳毒性研究（GenotoxicityStudy）是藥物非臨床安全性評價的重要內容，它與其他毒理學研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有著密切的聯繫，是藥物進入臨床試驗及上市的重要環節。擬用於人體的藥物，應根據受試物擬用適應症和作用特點等因素考慮進行遺傳毒性試驗。遺傳毒性試驗是指用於檢測通過不同機制直接或間接誘導遺傳學損傷的受試物的體外和體內試驗，這些試驗能檢出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大範圍染色體損傷、重組和染色體數目改變形式出現的DNA損傷的固定，一般被認為是可遺傳效應的基礎，並且是惡性腫瘤發展過程的環節之一（這種遺傳學改變僅在複雜的惡性腫瘤發展變化過程中起了部分作用）。在檢測此類損傷的試驗中呈陽性的化合物為潛在致癌劑和/或致突變劑，即可能誘導癌和/或遺傳性疾病。由於在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關係，而對於遺傳性疾病尚難以證明有類似的關係，故遺傳毒性試驗主要用於致癌性預測。但是，因為已經確定生殖細胞突變與人類疾病有關，所以對可能引起可遺傳效應的化合物與可能引起癌症的化合物應引起同樣的關注；此外，這些試驗的結果可能還有助於解釋致癌性的機制和試驗結果。因此，在藥物開發的過程中，遺傳毒性試驗的目的是通過一系列試驗來預測受試物是否有遺傳毒性，在降低臨床試驗受試者和藥品上市後使用人群的用藥風險方面發揮重要作用。本指導原則重點闡述遺傳毒性試驗體內外試驗的基本原則，並介紹標準試驗組合方案，以及對試驗結果的綜合分析及評價。本指導原則適用於中藥、天然藥物和化學藥物的遺傳毒性試驗研究。二、基本原則（一）實驗管理藥物的遺傳毒性試驗屬於安全性評價研究，根據《中華人民共和國藥品管理法》的規定，必須執行《藥物非臨床研究質量管理規範》。（二）具體問題具體分析遺傳毒性試驗的設計，應該在對受試物認知的基礎上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應根據受試物的結構特點、理化性質、已有的藥理毒理研究信息、適應症和適用人群特點、臨床用藥方案選擇合理的試驗方法，設計適宜的試驗方案，並綜合上述信息對試驗結果進行全面的分析評價。（三）隨機、對照、重複遺傳毒性試驗應符合毒理學試驗的基本原則，即隨機、對照和重複的原則。三、基本內容（一）受試物1、中藥、天然藥物受試物應能充分代表臨床研究受試物或上市藥品，因此受試物應採用製備工藝穩定、符合臨床研究質量標準規定的樣品，一般用中試樣品，並註明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等。如不採用中試樣品，應有充分的理由。如果由於給藥容量或給藥方法限制，可採用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明批號、規格及生產廠家。2、化學藥物受試物應採用製備工藝穩定、符合臨床研究用質量標準規定的樣品，並註明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等，並附有研製單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應標明批號、規格和生產廠家，並符合試驗要求。（二）試驗設計的總體考慮對藥物而言，需對潛在的遺傳毒性進行全面評價，遺傳毒性試驗可用作鑑定體細胞誘變劑、生殖細胞誘變劑和潛在的致癌物。目前，遺傳毒性試驗方法較多，所使用的生物材料多種多樣，可以利用原核細胞到真核細胞直至高等哺乳動物細胞在體外進行添加或不添加代謝活化物的試驗，也可在整體動物上進行體內試驗；根據試驗檢測的遺傳終點可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷與修復；從試驗系統來分，遺傳毒性試驗可分為體內試驗和體外試驗。因體內和體外試驗差異較大，以下分別討論體外試驗和體內試驗的基本要求。由於體內外的試驗方法均較多，本指導原則僅討論常用方法及需要重點關注的問題，具體試驗時需根據具體情況具體分析。1、體外試驗基本要求1.1細菌回復突變試驗中採用的基本菌株在細菌回復突變試驗中至少應採用5種菌株，包括用於檢測組氨酸靶基因中鳥嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點鹼基置換或移碼突變的4種組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA1535；TA1537/TA97/TA97a（注釋1）；TA98；TA100），以及用於檢測組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點鹼基置換或移碼突變的鼠傷寒沙門氏菌TA102或埃希氏大腸桿菌WP2uvrA或埃希氏大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）（注釋2）。由於檢測G-C位點突變的4種菌株無法檢測交聯劑，因此檢測交聯劑時最好採用TA102菌株或增加一種修復準確型大腸桿菌（如埃希氏大腸桿菌WP2uvrA（pKM101））。1.2體外試驗中最高濃度的確定（注釋3）體外試驗中受試物的最高濃度主要取決於受試物對細菌/細胞的毒性和溶解度。1.2.1無毒化合物的高濃度對易溶解的無毒化合物，細菌試驗應達到的最高濃度為5mg/皿，哺乳動物細胞試驗為5mg/ml或10mM（選用較低者）。1.2.2要求達到的細胞毒性水平在遺傳毒性體外試驗中，某些遺傳毒性致癌劑只有在檢測濃度高達可產生一定程度的細胞毒性時才可檢出，但毒性過高又可影響對相應的遺傳終點進行恰當的評價。當哺乳類動物細胞存活率很低時，一些遺傳毒性以外的作用機制如細胞毒性（如與細胞凋亡、溶酶體釋放核酸內切酶等有關的結果）會導致遺傳毒性的假陽性結果，這種情況常發生於受試物濃度達到毒性閾濃度時。鑒於以上情況，在體外細菌和哺乳類動物細胞試驗中，目前可接受以下的細胞毒性水平（濃度不應超過1.2.1中的規定）：（1）在細菌回復突變試驗中，最高濃度應能顯示明顯的毒性，如回復突變數減少、背景菌斑減少或消失。（2）哺乳動物細胞體外遺傳毒性試驗中，毒性水平應高於50%細胞抑制率或細胞融合率，對培養的淋巴細胞，有絲分裂指數抑制率應高於50%。（3）哺乳動物細胞體外基因突變試驗中，理想的最高濃度應能產生至少80%毒性（即存活率不大於20%）。可通過評價平板接種效率或相對總生長率測定毒性。對於細胞存活率低於10%時獲得的陽性結果，應謹慎對待。1.2.3難溶受試物的檢測在用細菌和哺乳動物細胞遺傳毒性試驗檢測某些受試物時，在不溶解的濃度範圍內也能檢測出劑量相關性的遺傳毒性（注釋4）。建議採用以下策略檢測相對不溶的受試物，該建議僅針對培養基中的受試物。（1）若未觀察到細胞毒性，應以產生沉澱的最低濃度作為最高濃度，但細菌試驗不超過5mg/皿，哺乳動物細胞不超過5mg/ml或10mM。（2）若觀察到劑量相關性的細胞毒性或誘變性，則不管溶解度如何，應按上述1.2.2要求的毒性水平來確定最高濃度，這需要檢測多個產生沉澱的濃度。但當沉澱量影響到結果觀察時，則無法達到所要求的細胞毒性的劑量水平。在給藥處理開始前和結束時，均套用肉眼評價沉澱量。1.3體外試驗的重現性體外試驗應關注重現性。體外試驗通常應進行重複試驗。但是，當採用標準的、已廣泛套用的常規體外試驗方法時，若這些試驗經過了充分驗證且進行了有效的內部質量控制，可不必進行重複試驗，例如：對哺乳動物細胞基因突變試驗，進行了規範的範圍確定試驗，其可提供足夠的數據以保證試驗方法的正確性；對體外染色體損傷的細胞遺傳學試驗和小鼠淋巴瘤tk試驗，採用了合適的、規範的方法，如包括有陽性和陰性對照、加和不加代謝活化的試驗、處理時間及採樣時間合適等。在進行這些試驗後，若得到明確的陽性或陰性結果，一般可不需要進行其他確證性試驗；但若得到可疑結果，則需要進一步試驗。2、體內試驗基本要求2.1體內試驗的給藥途徑一般情況下，給藥途徑應與臨床擬用途徑一致。若不一致，應說明理由。2.2體內檢測染色體斷裂劑的骨髓試驗嚙齒類動物骨髓有核細胞的染色體畸變試驗可以檢測多種染色體完整性方面的改變，該類變化幾乎均來源於原發性的單個或多個染色單體斷裂。如果產生了一個無著絲點片段，染色單體或染色體斷裂就導致微核形成，因而檢測染色體畸變或微核的方法可用於檢測斷裂劑（注釋5）。由於細胞分裂後期的一個或多個染色體相對滯後也能形成微核，因而微核檢測方法也能檢測一些非整倍體誘導劑（注釋6）。總之，體內骨髓細胞染色體畸變試驗或骨髓嗜多染紅細胞微核試驗均可用於檢測斷裂劑。此外也可以通過測定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）紅細胞的微核率來檢測斷裂劑，除小鼠外，也可採用其他脾臟無法清除帶微核的紅細胞或對斷裂劑或非整倍體誘導劑有足夠靈敏度的動物。2.3骨髓微核試驗中嚙齒類動物性別的選擇對小鼠微核試驗檢測已知斷裂劑的許多研究表明，通常雄性小鼠比雌性小鼠對誘導微核更敏感，二者之間僅有量的差異而無質的差異，但若性別間存在顯著的量的差別則會導致性別間的毒性不同。若性別間代謝產物有明顯的質的差別，則應採用二種性別的動物。類似的原則同樣適用於其他體內試驗方法（注釋7）。骨髓微核試驗可採用小鼠或大鼠。總之，在微核試驗中，除非性別間在毒性或代謝方面有明顯差異，一般單用雄性動物即可。如果受試物專用於一種性別，則通常選用相應性別的動物進行試驗。（三）標準試驗組合遺傳毒性試驗方法有多種，但沒有任何單一試驗方法能檢測出所有的遺傳毒性物質，因此，通常採用體外和體內遺傳毒性試驗組合的方法，以減少遺傳毒性物質的假陰性結果。這些試驗相互補充，對結果的判斷應綜合考慮。1、標準試驗組合應具備的特徵標準試驗組合應反映不同遺傳終點，包括體內和體外試驗，從原核到真核細胞，因此應包含以下內容：（1）應包含細菌回復突變試驗，因為該試驗已被證明能檢出相關的遺傳學改變和大部分嚙齒類動物遺傳毒性致癌劑。（2）因細菌不能完全檢測DNA損傷，應採用哺乳動物細胞進行評價。目前使用的幾種哺乳動物細胞系有：檢測染色體損傷的細胞系（染色體結構和數目畸變的體外試驗）；主要檢測基因突變的細胞系（注釋8）；檢測基因突變與染色體斷裂作用的細胞系（小鼠淋巴瘤tk試驗）（注釋9）。現有研究表明，對於檢測具有遺傳毒性但在細菌回復突變試驗中結果為陰性的化合物，在採用合適的試驗方案條件下，檢測染色體損傷的各種體外試驗與小鼠淋巴瘤tk試驗結果高度一致。因此，在標準試驗組合中，上述試驗系統可互相替換。（3）應包含一項遺傳損傷體內試驗，以提供一個包括影響受試物遺傳毒性作用的其他相關因素（吸收、分布、代謝、排泄）的試驗模型。體內試驗可另外檢出某些遺傳毒性物質（注釋10）。可採用嚙齒類動物造血細胞染色體損傷體內試驗或其他合適的體內試驗。嚙齒類動物染色體損傷體內試驗包括骨髓細胞染色體畸變試驗和骨髓細胞或外周血紅細胞微核試驗。2、推薦的標準試驗組合（1）一項體外細菌基因突變試驗；（2）一項採用哺乳動物細胞進行的體外染色體損傷評估試驗，或體外小鼠淋巴瘤tk試驗；（3）一項採用嚙齒類動物造血細胞進行的體內染色體損傷試驗。對於結果為陰性的受試物，完成上述三項試驗組合通常可提示其無遺傳毒性。對於標準試驗組合得到陽性結果的受試物，根據其治療用途，可能需要進行進一步的試驗。建議採用標準試驗組合併不意味著其他遺傳毒性試驗（如DNA加合物檢測，DNA鏈斷裂、DNA修復或重組試驗）不合適，這些試驗可作為標準試驗組合以外的供選試驗，以進一步驗證或補充標準試驗組合得到的遺傳毒性試驗結果。此外，用分子生物學技術對遺傳毒性作用機制進行研究，將有利於危險度評估。在某些情況下，標準試驗組合中的一項或多項試驗對受試物不適合時，可採用其他替代試驗，但應提供充分的科學依據。標準試驗組合不包括為檢測非整倍體而設計的特定試驗。但是，從體外和體內染色體損傷試驗中可得到非整倍體損傷的信息，如有絲分裂指數升高、多倍體產生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk試驗對於非整倍體誘導劑的檢測也能提供一些有用的信息。出現上述情況時可能需要進行進一步的試驗。附錄部分簡介標準試驗組合中常用的幾種試驗方法，該部分內容只是基本原則，具體試驗時需根據具體情況具體分析，設計合適的試驗方法。3、標準試驗組合的調整標準試驗組合在一些特殊情況下不適合，需要根據情況進行調整。（1）在一些情況下，細菌回復突變試驗不能提供合適的或足夠的信息以評價遺傳毒性，如對細菌毒性過大的受試物（如某些抗生素）和可能或已知可干擾哺乳動物細胞複製的受試物（如拓撲異構酶抑制劑、核苷酸同系物或DNA代謝抑制劑）。在這種情況下，體外試驗部分可改用二種不同類型細胞和二種不同終點（基因突變和染色體損傷）的體外哺乳動物細胞試驗。（2）三項標準試驗組合一般可檢出具有遺傳毒性作用的可疑結構的受試物（注釋11）。但是，對此類結構的受試物，在三項試驗組合中的結果為陰性時，需要適當增加一些試驗，應根據其化學性質、已知反應性和代謝資料來選擇附加試驗或調整實驗方案。（3）對於某些特殊的受試物，如毒代或藥代動力學研究表明不被全身吸收，在標準體內遺傳毒性試驗中無法到達靶組織（注釋12）的受試物，如放射影像劑、抗酸鋁合劑和一些皮膚用藥，對這些受試物，標準組合的體內試驗難以提供有用的附加信息。若改變給藥途徑也不能提供足夠的靶組織暴露時，可僅根據體外試驗進行評價。（四）與致癌試驗相關的附加遺傳毒性試驗1、腫瘤產生的相關證據對於標準遺傳毒性組合試驗結果為陰性而在致癌試驗中出現陽性結果但不能確定具有非遺傳毒性作用機制的受試物，建議採用合適模型的附加遺傳毒性試驗。為了有助於了解作用機制，附加試驗可以改變體外試驗的代謝活化條件或者進行腫瘤靶器官的遺傳損傷的體內試驗（例如：肝UDS試驗，32P-後標記試驗，轉基因突變測定，腫瘤相關基因遺傳改變的分子特徵研究）。2、具有特異結構的化合物在極個別情況下，具有特異結構的全新化合物可能會被開發為新藥。當不進行該化合物的嚙齒類動物長期致癌試驗時，應該對其遺傳毒性進行深入評估。四、結果分析與評價遺傳毒性研究是藥物安全性評價與藥物整體開發進程的一個有機組成部分，其最終目的在於預測受試物潛在的遺傳毒性或致癌性。試驗結果的分析和評價是試驗的必要組成部分，應對研究結果進行科學和全面的分析和評價。在對遺傳毒性試驗結果進行評價時，應結合受試物的藥學特點、藥效學、藥代動力學和其他毒理學研究的結果等信息進行綜合分析。中藥、天然藥物還應結合處方組成特點、方中藥味毒性情況、臨床套用背景情況等進行綜合分析。試驗結果的評價最終應落實到臨床研究受試者範圍限定、風險效益評估以及必要防治措施的制定和套用上。遺傳毒性試驗組合檢測的是主要通過直接的遺傳損傷機制的致癌劑（如絕大多數已知的人類致癌劑），該類組合無法檢測出非遺傳毒性致癌劑。體外試驗的一些實驗條件，如有限的體外代謝活化能力，可能導致假陰性結果，但是，任何一種遺傳毒性試驗中的陽性結果並不一定能說明受試物對人體真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。在對體內外試驗結果進行評價時，對陽性或陰性的結果均應予以充分考慮，尤其是在有疑義時。因此，需進行綜合分析和評價。（一）體外試驗結果的評價1、體外試驗陽性結果在評價體外試驗陽性結果的生物學意義時，應考慮以下幾個問題：（1）與陰性或溶劑對照數據及背景數據比較，是否有意義？（2）是否有劑量相關性？（3）弱或可疑的陽性結果是否可重現？（4）陽性結果是否由於體外獨特的代謝活化途徑或體外特殊的活性代謝物所致（注釋13）？（5）結果是否可歸因於體內不存在的體外極端培養條件，如極端的pH值、滲透壓、細胞懸液中的沉澱物？（6）哺乳類動物細胞試驗中，陽性結果是否僅出現在存活率極低的濃度？（7）陽性結果是否歸因於某種污染物（當某些化合物不存在可疑結構或僅為弱誘變劑或僅在很高濃度時才有誘變性時，可能發生該種情形）？（8）某種特定遺傳終點的試驗結果是否與同類化合物中其他化合物的試驗結果一致？（9）有無其他可能的情況。通過以上考慮，綜合分析該陽性結果是否有生物學意義。2、體外試驗陰性結果在評價體外試驗陰性結果時，應慎重考慮以下問題：（1）受試物的化學結構或已知代謝是否提示採用的標準體外代謝活化技術（如嚙齒類動物肝臟S9）可能不合適？（2）化合物的結構或已知反應性是否提示採用其他檢測方法或系統更合適？（3）有無其他可能的情況。（二）體內試驗結果的評價與體外試驗相比，體內試驗方法具有考慮到與人體套用相關的吸收、分布、排泄的優點，而且體內代謝相對於體外試驗中的代謝系統更具有相關性，因此，體內試驗在遺傳毒性試驗中具有更重要的意義。一些已經確證的體內方法可用於評價遺傳毒性，其中包括骨髓或外周血細胞遺傳學試驗。若某受試物體外試驗結果為陰性，一般僅需進行一種體內細胞遺傳學試驗。對於在一種或多種體外試驗中顯示有生物學意義的陽性結果的受試物，在進行一種體內細胞遺傳學試驗的基礎上，採用骨髓或外周血以外的組織進行進一步的體內試驗可提供更有用的信息（注釋14）。受試物體內作用的靶細胞以及體外試驗的檢測終點有助於選擇附加的體內試驗。如果體外與體內試驗的結果不一致，對其中的差異應採用具體問題具體分析的原則進行考慮和分析。評價受試物的潛在遺傳毒性時，應全面考慮各項試驗結果、體內和體外試驗方法的內在價值及其局限性。1、體內試驗結果陰性時，確定靶組織暴露水平的原則體內試驗結果的意義與確定受試物在靶組織（注釋12）中有足夠的暴露直接相關，尤其是當體外試驗顯示出確定的陽性結果而體內試驗結果為陰性時更為重要。由於靶組織以外的組織中出現了劑量限制性的毒性，因此靶組織中通常很難達到足以誘發生物學反應（如毒性）的濃度。在這種情況下，毒代動力學資料能提示在靶組織中的暴露情況。如果由於受試物在靶組織中利用度很低或蛋白結合率高等原因以致無法達到足夠的暴露量，此時常規的體內遺傳毒性試驗的意義較小。以下建議適用於骨髓細胞遺傳學試驗，如果用其他靶組織，類似的原則也可採用。對於任何一種體外試驗方法結果呈陽性、而體內試驗結果為陰性的受試物，應採用以下任何一種方法反映受試物在體內的暴露水平：（1）通過測定微核試驗中在各劑量組和各採樣時間點骨髓中未成熟紅細胞數與紅細胞總數的比例發生的顯著變化，或通過測定染色體畸變試驗中有絲分裂指數顯著的降低，間接反映受試物的暴露水平。（2）通過測定血液或血漿中的水平反映受試物相關物質的生物利用度（注釋15）。（3）直接測定骨髓中的受試物相關物質。（4）通過放射自顯影檢測組織暴露水平。對於方法（2）～（4），應先在最高劑量或其他相關劑量採用與骨髓試驗相同的動物種屬品系及給藥途徑進行檢測。若體外試驗未顯示受試物有潛在遺傳毒性，可採用上述任何一種方法，也可用嚙齒類動物吸收、分布、代謝和排泄試驗結果來確定體內（系統）暴露水平。2、生殖細胞誘變劑的檢測遺傳毒性對生殖細胞的影響也極其重要。有關生殖細胞誘變劑檢測的比較研究結果顯示，大多數生殖細胞誘變劑能在體細胞試驗中檢出，而體內體細胞遺傳毒性試驗的陰性結果通常可提示受試物對生殖細胞也無影響。體內體細胞試驗結果為陽性時，在綜合評價及指導用藥時應關注受試物對生殖細胞的影響。（三）綜合分析與評價當遺傳毒性結果為陽性時，對進入臨床試驗是否安全，應考慮所有的安全性資料，包括對所有遺傳毒性資料的全面評價和擬進行的臨床試驗的性質。如果這些遺傳毒性試驗的結果提示無潛在的遺傳毒性，則臨床研究一般可在健康受試者和擬用臨床適應症的病人中進行。對於遺傳毒性試驗出現陽性結果、但不直接與DNA發生作用的受試物，不是全都會帶來明顯的體內給藥的風險。因此，當遺傳毒性試驗出現陽性結果時，建議提供有關遺傳毒性機制的證據以及這種機制與預期體內暴露的相關性，或者通過試驗排除藥物為非直接與DNA作用的機制，如證明受試物不使DNA烷化或DNA鏈斷裂。若確認受試物可直接損傷DNA，在極特殊情況下，可能會允許用於危及生命的疾病（如癌症），但不能在健康受試者中使用。當受試物的標準三項試驗組合中的任何一項試驗結果為陽性時，建議完成標準試驗組合中的第四種試驗。若結果模稜兩可，需重複試驗以確定結果的可重現性。若一項或多項試驗結果為陽性，需採用證據權衡法（注釋16）、進行作用機制研究或附加的支持性試驗（注釋17）以確認受試物是否會引起遺傳毒性。五、遺傳毒性研究進行的時間通常情況下，對於（1）新的化學藥物；（2）中藥、天然藥物中的：①新的有效成分及其製劑；②新的藥材及其製劑；③新的中藥材代用品；④藥材新的藥用部位及其製劑；⑤處方中含有無法定標準的藥材，或來源於無法定標準藥材的有效部位，以及用於育齡人群並可能對生殖系統產生影響的新藥（如避孕藥、性激素、治療性功能障礙藥、促精子生成藥、保胎藥或有細胞毒作用等的新藥），在人體試驗開始前，應完成標準組合的遺傳毒性試驗。若出現可疑或陽性試驗結果，應進一步進行其他相關試驗。對於其他需進行遺傳毒性研究的中藥、天然藥物，如長期毒性試驗中發現有異常增生、處方中含有高度懷疑的遺傳毒性的藥味或成分等，應根據具體情況提供相應的遺傳毒性研究資料，並根據具體情況來確定所需要進行的遺傳毒性試驗的內容及進行的時間。由於中藥製劑尤其是中藥複方製劑有其特殊性，如含有生藥粉的製劑、不溶物較多、成分複雜、溶解度較差、pH值等問題，難以進行體外試驗者，可選擇進行合適的體內試驗，但必須充分說明理由。六、參考文獻1.ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineS2A：Guidanceonspecificaspectsofregulatorygenotoxicitytests.19952.ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineS2B：Genotoxicity:Astandardbatteryforgenotoxicitytestingofpharmaceuticals.19973.ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineM3:Non-clinicalsafetystudiesfortheconductofhumanclinicaltrialsforpharmaceuticals.20004.FDA.Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetictoxicologystudyresults.20065.致突變試驗。見：新藥（西藥）臨床前研究指導原則彙編（藥學、藥理學、毒理學）。中華人民共和國衛生部藥政局，1993:211-2166.特殊毒性試驗。見：中藥新藥研究指南（藥學、藥理學、毒理學）。中華人民共和國衛生部藥政局，1994:216-2217.秦伯益主編.新藥評價概論，第二版.人民衛生出版社.北京，1999：207-2318、8.袁伯俊、王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐，第一版.軍事醫學科學院出版社.北京，19979.遺傳毒性試驗。見：日本臨床前研究指導原則解說。藥事日報社，2002：25-34，167-19010.CrutisD.Klaassen.Casarett&Doull’sToxicology,6thedition，人民衛生出版社，200211.OECDGuidelineforTestingofChemicals.471Bacterialreversemutationtest.199712.OECDGuidelineforTestingofChemicals.473InVitroMammalianchromosomeaberrationtest.199713.OECDGuidelineforTestingofChemicals.474Mammalianerythrocytemicronucleustest.199714.OECDGuidelineforTestingofChemicals.476InVitroMammaliancellgenemutationtest.1997七、著者《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》課題研究組。八、相關注釋注釋1：TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重複序列，其位於相應的組氨酸靶位點內的突變敏感部位，它們對導致這些移碼熱點中鹼基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似，因此該三種菌株可相互代替。注釋2：有將A-T靶位點突變的菌株包含在測試組合中可檢測出一些遺傳毒性致癌劑的相關文獻報導（如Levin等，1983；Wilcox等，1990）。日本勞務省對5525種化合物的資料庫進行分析（以及由各個製藥公司對較小的資料庫進行分析）的結果表明，約7.5%的細菌誘變劑是由大腸桿菌WP2uvrA而非4種鼠傷寒沙門氏菌株標準組合檢出。儘管尚未獲得這些化合物對動物致癌性的資料，但它們很可能具有與誘導鼠傷寒沙門氏菌株標準組合變化的誘變劑同樣的潛在致癌性。注釋3：此處所指最高濃度的確定主要針對化學藥物，因中藥、天然藥物所包含範圍過寬（如有效成分類、有效部位類、中藥複方類等），情況過於複雜，在合適時可參考化學藥物的最高濃度的確定原則進行設計，不合適時需根據具體情況進行合理的設計。注釋4：出現這種情況可能是培養基中的血清或S9混合液成分增加了沉澱物的溶解性，也可能是細胞膜脂質層易化了細胞對脂溶性物質的吸收；此外，某些類型的哺乳類動物細胞具有內吞噬作用（如中國倉鼠V79、CHO和CHL細胞），能攝取固態顆粒，隨後將其分散於胞漿中。某些不溶性化合物也可能含有可溶性的遺傳毒性雜質。並且許多不溶性藥物是以混懸液或顆粒狀給予人體的。但是另一方面，沉澱物可能幹擾結果的觀察，並使得暴露的程度難以控制（如用離心方法從暴露介質中分離細胞時），或使受試物無法進入細胞與DNA發生作用。已發現一些物質僅在產生沉澱的濃度範圍內才顯示出明確的遺傳毒性，這些物質包括化合物的聚合物和混合物、某些多環苯烴、某些苯丙胺、七氯化合物等。有關其中一些物質的協作研究結果表明，它們的遺傳毒性在可溶範圍內可被檢出，但在不溶性的範圍內明顯增高。注釋5：因微核形成機制與誘導染色體畸變有關，微核試驗及染色體畸變試驗均可用於篩選斷裂劑。對相同受試物的小鼠微核試驗與大鼠骨髓中期相分析的比較研究表明，在定性（即檢測斷裂劑的能力）和定量（即確定誘導斷裂的最低劑量）這兩方面均高度相關。採用同種動物進行試驗時，可望得到更為一致的結果。注釋6：雖然微核的形成源於受試物與紡錘體相互作用導致整條染色體分裂的滯後，但微核試驗無法檢測所有非整倍體誘導劑。更特異的非整倍體畸變檢測方法之一即是採用快速、靈敏的技術分析個體（嚙齒類動物）分裂間期核中的染色體，如原位螢光分子雜交（FISH）方法。注釋7：鑒於微核和染色體畸變的誘導具有相關性，因而用雄性動物進行骨髓染色體畸變試驗時，套用相同的實驗條件是合理的。外周血微核試驗和體內前處理的UDS試驗一樣僅在雄性嚙齒類動物中得到驗證。注釋8：目前被接受的評價哺乳動物細胞基因突變的試驗方法包括小鼠淋巴瘤L5178Y細胞或人淋巴母細胞TK6細胞tk試驗，CHO細胞、V79細胞或L5178Y細胞hprt試驗，AS52細胞gpt試驗。注釋9：對在tk位點誘導的突變體分子分析顯示存在多種遺傳學變化，包括點突變、缺失、移位、重組等。對小集落突變體分析顯示tkb等位基因的缺失是染色體結構或數目的改變或重組的結果。有證據表明其他位點，如hprt或gpt也對染色體的大範圍缺失敏感，但由於來源於X染色體的的hprt基因很可能位於生命必需基因（Essentialgenes）的側面，染色體的大範圍缺失或數目改變往往不引起突變集落，因此對於檢測多種遺傳學改變，該遺傳位點的靈敏度不如tk位點。注釋10：有少數明顯的遺傳毒性致癌劑確能被骨髓染色體損傷試驗檢出，但在標準組合選擇的幾對體外試驗中，如細菌回復突變試驗和一項可選擇的染色體損傷細胞遺傳學評價試驗組合，或細菌突變試驗和小鼠淋巴瘤tk試驗組合，卻得到陰性、弱陽性或相互矛盾的結果。丙卡巴肼、氫醌、氨基甲酸乙酯、苯等致癌劑即屬於此類。注釋11：某些具有遺傳毒性可疑結構的分子單體與化合物的致癌和/或致突變有關。可疑結構包括烷化親電子中心、不穩定過氧化物、芳香胺、偶氮結構、N-亞硝基基團、芳香硝基基團。注釋12：靶組織：此處特指體內試驗的檢測目標組織，如小鼠骨髓微核試驗中的骨髓。注釋13：已有文獻報導關於體內和體外試驗結果之間差異的問題，差異包括：（a）體外形成的代謝產物未必在體內形成；（b）活性代謝產物可能在體內迅速被解毒而體外則不能；（c）受試物在體內可迅速、有效地被排泄等。注釋14：雖骨髓或外周血以外組織進行的體內試驗可提供有用的信息，但是至今仍無一種已經驗證並廣泛套用的檢測基因突變的體內試驗方法。一些用大鼠或小鼠某些組織中的內源性基因或轉基因的體內基因突變方法還處於研究階段。在這類方法得到公認之前，採用骨髓以外的組織檢測遺傳毒性的體內試驗方法可進一步提供一些有價值的數據，但應對選用該方法的合理性進行科學驗證。如對於體內肝程式外DNA合成（UDS）試驗，對文獻的回顧表明，將肝UDS試驗和骨髓微核試驗二種方法組合，可檢測出大多數遺傳毒性致癌劑，且假陽性率較低。但是，某些不穩定的遺傳毒性化合物和某些芳香胺，用該組合試驗檢測雖然也得到陰性結果，但是，在很多體內試驗方法卻證明這些化合物是有問題的，因此，進一步的體內試驗結果不應僅局限於肝UDS試驗，其他方法如32P後標記、DNA鏈斷裂試驗等也應予以考慮。注釋15：對眾多藥物進行二室間藥物水平的直接比較的研究表明，骨髓是血液灌流性良好的組織，故血液或血漿中藥物相關物質的水平與骨髓中水平相似。雖然藥物濃度不總是完全一致，但是檢測血液或血漿中藥物濃度與確定骨髓中暴露水平有足夠的相關性。注釋16：在某些情況下，在對所有現有資料進行評估後，證據權衡提示無遺傳毒性危害。例如，在體外細胞遺傳學試驗的一種暴露方案下出現了陽性反應，該陽性結果僅在高劑量時出現，而發生率升高的程度在所用溶劑和細胞系的歷史對照數據範圍內或剛剛超出該範圍。證據權衡後可能提示，雖然染色體異常頻率的輕微升高有統計學意義，但無生物學相關性。有幫助的考慮因素包括（1）在出現陽性結果的劑量時細胞毒性的水平；（2）相同試驗或補充試驗的確證性數據。例如，在無代謝活化下短期暴露時出現陽性結果，但在相當細胞毒性水平的長期暴露中未得到確證，這時陽性結果可能不具有生物學意義。與之類似，在體外染色體畸變試驗得到陽性結果，而在相當暴露方案下小鼠淋巴瘤試驗未得到確證，也可對該陽性結果的意義產生疑問。如果證據權衡法提示無遺傳毒性危害，可進行重複給藥的臨床試驗，該陽性結果應寫入研究者手冊和知情同意書中。注釋17：一些情況下，體外遺傳毒性試驗顯示出可重複性的陽性結果，而體內骨髓細胞遺傳學試驗結果經常為陰性，這種差異可能來源於體內外試驗生物系統、代謝途徑、藥物濃度等差異。這種情況下，為確證體外試驗陽性結果，進行附加的體內試驗很有價值。例如，小鼠重複給藥毒性試驗中進行外周血塗片可用來評估誘導微核的作用，大鼠或猴重複給藥毒性試驗進行外周血淋巴細胞培養可用於評估細胞分裂中期的染色體損傷。在潛在的靶組織中應評估DNA損傷（如通過彗星或鹼基洗脫試驗來評估DNA加合物或DNA鏈斷裂），或用轉基因大鼠或小鼠來評估在可能的靶組織中的誘變性。當體外遺傳毒性試驗結果為陽性時，敘利亞倉鼠胚胎細胞（SHE）轉化試驗可用作附加試驗。一些轉基因小鼠也可以在短期致癌性試驗中套用，如研究顯示p53單一缺陷小鼠可用於致突變性致癌劑的鑑定。九、附錄推薦的標準試驗組合中的遺傳毒性試驗方法註：以下方法中所提供的最高濃度和最高劑量設計原則主要針對化學藥物，中藥、天然藥物由於情況複雜，應綜合考慮多方面因素，不能簡單套用該原則，試驗時應根據具體情況進行合理的設計。（一）細菌回復突變試驗（Bacterialreversemutationtest）1、菌株組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和/或色氨酸營養缺陷型埃希氏大腸桿菌，至少應包含下述五種菌株組合（除特殊說明外，均為鼠傷寒沙門氏菌）：（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大腸埃希桿菌WP2uvrA或大腸埃希桿菌WP2uvrA（pKM101）。菌株特性鑑定需符合要求，-80℃或液氮凍存備用。2、濃度至少應包含5個可用於結果分析的濃度。最高濃度主要取決於受試物對細菌的毒性和/或溶解度：a、對於可溶性的無毒受試物，推薦的最高測試濃度一般為5mg/皿；b、對於可溶性的有細菌毒性的受試物，應根據殺菌或抑菌情況確定最高濃度（詳見正文1.2.2）；c、對於難溶性的受試物，一般採用最小沉澱濃度為最高濃度；若觀察到濃度相關性的細胞毒性或誘變性，則要求檢測多個產生沉澱的濃度（詳見正文1.2.3）。3、代謝活化一般採用誘導劑，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯合誘導處理後的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在S9混合液中的濃度一般為5～30%（v/v）。4、對照代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的菌株特異性的陽性致突變劑。5、方法可採用標準平板摻入法或預培養法，受試物處理後48～72小時觀察結果。每一濃度至少平行三皿。實驗至少重複一次。6、結果判定結果中應描述各濃度組細菌毒性大小和沉澱情況，結果表示為每皿的回覆突變菌落數，並計算各組的均值和標準差。至少在一個菌株上，在有或無代謝活化的情況下，受試物所誘發的回覆突變菌落數出現濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度組上出現可重複性的增加，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統計學方法有助於對結果的評價，但是統計學意義不是陽性反應的唯一標準。（二）體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗（InvitroMammalianchromosomalaberrationtest）1、細胞可採用哺乳動物或人的細胞進行試驗，如CHL細胞、CHO細胞、人外周血淋巴細胞等，細胞系需定期檢查核型和有無支原體污染等。-80℃或液氮凍存備用。2、濃度至少應包含3個可用於結果分析的濃度。最高濃度主要取決於受試物的細胞毒性和/或溶解度，中、低濃度一般採用倍比稀釋法：a、對於可溶性的無毒受試物，推薦的最高測試濃度一般為5mg/ml或10mM（選用較低者）；b、對於可溶性的有細胞毒性的受試物，應根據細胞毒性大小確定最高濃度，如通過活細胞計數、細胞融合率或有絲分裂指數等確定，一般毒性應大於50%（詳見正文1.2.2）；c、對於難溶性的受試物，一般採用最小沉澱濃度為最高濃度；若觀察到濃度相關性的細胞毒性或誘變性，則要求檢測多個產生沉澱的濃度（詳見正文1.2.3）。3、代謝活化一般採用誘導劑，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯合誘導處理後的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在試驗介質中的終濃度一般為1～10%（v/v）。4、對照代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的陽性致突變劑。5、方法處理及細胞收穫時間：在代謝或非代謝活化的情況下，受試物和細胞作用3～6小時，在1.5個細胞周期時收穫細胞。若均得到陰性結果，需在非代謝活化條件下，受試物和細胞應持續作用至1.5個細胞周期時收穫細胞。對某些受試物與細胞接觸時間/收穫細胞時間可能要大於1.5個細胞周期。讀片分析：一般油鏡下每種濃度至少觀察200個分散良好的中期分裂相細胞，若觀察到大量染色體畸變細胞，分析細胞數可相應減少。應分別記錄各組含有結構畸變染色體的細胞數和畸變類型，裂隙應單獨記錄，但不計入畸變率中。同時應單獨記錄多倍體和內複製等數目畸變，但不計入畸變率中。6、結果判定結果中應描述各濃度組細胞毒性大小和沉澱情況，結果表示為染色體結構畸變細胞的百分率。受試物所誘發的染色體畸變率出現濃度依賴性的增加，或出現可重複性的增加，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統計學方法有助於對結果的評價，但是統計學意義不是陽性反應的唯一標準。多倍體數目的增加提示受試物可能會抑制有絲分裂或誘導染色體數目畸變。出現染色體內複製的細胞數增多提示受試物可能會影響細胞周期。（三）小鼠淋巴瘤細胞試驗（Mouselymphomaassay，MLA）1、細胞通常採用小鼠淋巴瘤L5178Ytk+/-?3.7.2C細胞，需定期檢查核型或有無支原體污染等，必要時進行自發突變細胞的清除。-80℃或液氮凍存備用。2、濃度至少應包含4（平行處理）～8（單處理）個可用於結果分析的濃度。最高濃度主要取決於受試物的細胞毒性和/或溶解度，中、低濃度一般採用倍比稀釋法：a、對於可溶性的無毒受試物，推薦的最高測試濃度一般為5mg/ml或10mM（選用較低者）；b、對於可溶性的有細胞毒性的受試物，應根據細胞毒性大小確定最高濃度，如通過評價平板接種效率或相對總生長率確定細胞毒性，最高濃度應能產生至少80%毒性（即存活率不大於20%）。對於細胞存活率低於10%的陽性結果，應謹慎對待（詳見正文1.2.2）。c、對於難溶性的受試物，一般採用最小沉澱濃度最為最高濃度；若觀察到濃度相關性的細胞毒性或誘變性，則要求檢測多個產生沉澱的濃（詳見正文1.2.3）。3、代謝活化一般採用誘導劑，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯合誘導處理後的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在試驗介質中的終濃度一般為1～10%（v/v）。4、對照代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的陽性致突變劑。5、方法一般採用微孔法進行試驗。藥物處理時間：在代謝活化或非代謝活化條件下，一般受試物與細胞作用3～4小時。如果受試物作用3～4小時後結果為陰性，還需進行在無代謝活化條件下作用24h的附加試驗進一步確定。突變表達期：受試物與細胞作用3～4小時後，去除受試物，將細胞重懸於培養液中，一般L5178Y細胞的突變表達期為2天，分別在處理結束後及表達期結束後測定平板接種效率以確定細胞毒性。突變率測定：表達期結束後，將細胞接種於含有突變選擇劑三氟胸苷（TFT）的96孔板中進行TFT抗性突變集落的測定。如果受試物出現陽性結果，則至少有一個受試物濃度組（一般為最高濃度）和陰性、陽性對照組需要分別記錄含有大、小集落的孔數；如果為陰性結果，僅陰性和陽性對照組需要分別記錄含有大、小集落的孔數。6、結果判定結果中應描述各濃度組細胞毒性大小和沉澱情況，結果表示為各濃度組的突變率。如果一個或多個濃度組出現濃度依賴性和/或可重複性的突變率增加，則判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統計學方法有助於對結果的評價，但是統計學意義不是陽性反應的唯一標準。如果出現明確的陽性結果，則不需要重複試驗；如果出現可疑結果則需要重複試驗；如果代謝活化條件下為陰性結果，可依據具體問題具體分析的原則考慮是否需要重複試驗，若不進行重複試驗時需說明理由。在重複試驗中，可以考慮改變劑量間距或代謝活化條件。（四）哺乳動物體內微核試驗（Mammalianerythrocytemicronucleustest）1、動物骨髓試驗通常採用小鼠和大鼠，如合適也可選用其他哺乳動物。檢測外周血時推薦採用小鼠。但是如果是脾無法清除帶微核的紅細胞的種屬，或已證明用於檢測可引起結構和/或數目的染色體畸變的藥物有足夠敏度的種屬也可使用。採用健康性成熟動物，建議採用雄性，每組至少6隻。若性別間存在明顯的毒性或代謝方面的差異，則應採用兩種性別的動物，每組雌雄至少各5隻。如果受試物專用於一種性別，則通常選用相應性別的動物進行試驗。起始試驗時，動物體重差異應在各性別平均體重的20%之內。2、劑量至少應設定3個劑量組，根據相關毒性試驗或預試驗的結果確定高劑量，高劑量應產生一定的毒性症狀或骨髓毒性（如嗜多染紅細胞在紅細胞總數中的比例降低）。對於低毒性化合物，給藥時間≤14天的推薦最高劑量為2000mg/kg/d，給藥時間>14天的推薦最高劑量為1000mg/kg/d；對於單次給藥或一天內多次給藥達2000mg/kg/d仍無毒性的化合物，設定3個劑量組的意義不大。3、對照應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的陽性致突變劑。4、方法給藥方案：根據具體情況選擇合適的給藥方案，可採用單次給藥（或24小時內多次給藥）或重複給藥。受試物的給藥途徑應儘可能與臨床擬用途徑相同，陰性對照物必須與受試物給藥途徑一致，陽性對照物的給藥途徑可以不同於受試物。骨髓採樣時間：如果採用單次給藥，至少應採樣2次，骨髓採樣時間應在給藥後24～48小時內，外周血採樣時間應在給藥後36～72小時內。受試物第一個採樣點應至少包括3個劑量組，第二個採樣點可僅包括高劑量組。如果採用重複給藥，可只採樣1次，骨髓採樣時間應在末次給藥後18～24小時，外周血採樣時間應在末次給藥後36～48小時。鏡檢：每隻動物至少計數200（骨髓）或1000（外周血）個紅細胞以確定嗜多染紅細胞（PCE）和總紅細胞（嗜多染紅細胞和正染紅細胞（NCE））的比例；至少計數2000個嗜多染紅細胞以判斷嗜多染紅細胞的微核率。給藥組嗜多染紅細胞和總紅細胞的比例不應低於對照組的20%。如果給藥時間在4周以上，可以直接計數2000個紅細胞中的微核率。5、結果判定結果中應描述各劑量組的毒性大小，包括一般症狀和PCE/（PCE+NCE）的比例，結果表示為各劑量組的嗜多染細胞微核率（MNPCE）。受試物所誘發的微核率出現有劑量依賴性的升高，或某一劑量組在某一測試點呈現可重複性的明顯升高，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統計學方法有助於對結果的評價，但是統計學意義不是陽性反應的唯一標準。如果出現可疑陽性時需重複試驗以確證結果，在重複試驗中可考慮改變試驗條件。