苯酚-硫酸法

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。

基本介紹

• 中文名：苯酚-硫酸法
• 原料：多糖
• 條件：硫酸的作用
• 濃硫酸：分析純，95.5%

試劑

1． 濃硫酸：分析純，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰櫃中避光長期儲存。

3． 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配製。（每次測定均需現配）

4． 標準葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析純葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰櫃中長期儲存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰櫃中長期儲存。

7． 6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。

8． 6mol/L 鹽酸

操作

1．製作標準曲線：準確稱取標準葡聚糖（或葡萄糖）20mg於500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，沸水浴顯色15min以後於490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標準曲線。

2．樣品含量測定：

①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5%TCA溶液研磨，倒上清液於10毫升離心管中，再加少許5%TCA溶液研磨，倒上清液，重複3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。

②離心，轉速3000轉/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。後兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時，每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時。

④定容取樣。水浴後，用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標準曲線計算多糖含量。

注意

（1）此法簡單、快速、靈敏、重複性好，對每種糖僅製作一條標準曲線，顏色持久。

（2）製作標準線宜用相應的標準多糖，如用葡萄糖，應以校正係數0.9校正μg數。

（3）對雜多糖，分析結果可根據各單糖的組成比及主要組分單糖的標準曲線的校正係數加以校正計算。

（4）測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。