利用溶質和吸附劑表面之間弱的疏水性相互作用而被吸附的過程稱為疏水吸附。疏水作用的強度隨著鹽濃度的增加而增加，因此，在高鹽濃度下大部分溶質(蛋白質)被惰性基質上的疏水基團所吸附，而當淋洗液的離子濃度逐漸降低時，蛋白質樣品則按其疏水特性被依次洗脫下來，疏水性越強洗脫時間越長，用此原理實現分離。
基本介紹
- 中文名：疏水吸附
- 外文名：Hydrophobic adsorption
- 套用學科：環境工程
- 適用領域範圍：環境生態
- 基本材料：疏水吸附劑
- 目的：分離純化蛋白質
簡介,基本原理,疏水吸附劑,疏水層析的條件,疏水吸附的套用,
簡介
疏水吸附層析是70年代興起的一種新技術。它對蛋白質混合物有很好的分離效果。目前，這一技術已廣泛地用於蛋白質及其它生物大分子的分離純化。
在親和層析載體的發展中，發現某些蛋白質即使不存在帶電末端(氨基或羧基)也能與1，6-亞己基間隔臂發生強烈的連線，這是由於在吸附劑上的脂肪族長鏈和生物分子表面上疏水區相互作用的結果，該發現使疏水層析技術得到了很好的套用。
基本原理
疏水吸附層析的基本材料是疏水吸附劑。疏水吸附劑是由球狀的載體與疏水基團共價結合而成的。在疏水吸附劑顆粒的表面上，分布著許多的疏水基團。在球狀蛋白質分子的表面上，有疏水區和疏水口袋。它是由一些疏水胺基酸殘基的疏水基團構成的。將懸浮於吸附緩衝液的疏水吸附劑裝進層析柱內，構成柱床，然後，將溶於吸附緩衝液的樣品(蛋白質混合物，含目的蛋白質)加入柱床。在吸附條件下，由於疏水吸附劑的疏水基團與蛋白質分子的疏水基團之間的疏水相互作用，因而，使蛋白質吸附在吸附劑的表面上。然後，改變洗脫條件，減弱疏水相互作用，從而使蛋白質從吸附劑上解吸下來。影響疏水相互作用的因素有兩個：一是蛋白質的疏水性。不同蛋白質的疏水區和疏水口袋，在數目、大小、形狀和親脂性上各不相同，因而與吸附劑的吸附力有差異。二是蛋白質的環境。在水相中提高中性鹽的濃度或降低乙二醇的濃度，可以增強疏水基團間相互作用力，反之，則減弱這種作用力。疏水層析，就是通過對疏水相互作用強弱的調控，來達到分離純化蛋白質的目的。
疏水吸附劑
疏水作用吸附需要使用疏水作用的吸附劑，它與其他吸附技術所用的吸附劑相類似，由作為骨架的基質和鍵合在基質上參與疏水作用的配基組成。
①基質可分為“軟基質”，其中以瓊脂糖使用最廣泛，另外還有葡聚糖、高分子聚合物和纖維素等；“硬基質”主要是大孔徑矽膠。瓊脂糖一類凝膠的優點是親水性強，表面羥基密度非常大，衍生化後可產生取代程度和結合容量較大的吸附劑，其大孔結構適合於大分子蛋白質的分離，且pH值穩定性良好。矽膠的特點是硬度大，機械穩定性高，但其表面可供衍生的基團少，且僅在pH值2～8範圍內穩定，因此其套用受到限制。但後來採用了聚合物包裹技術，在矽膠或其他有機聚合物表面包裹一層帶有可衍生基團的高分子材料，從而克服了上述缺點，使其具備良好的分離性能，得到了廣泛的使用。
②疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基(C3～C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基與親水性基質之間的偶聯主要利用氨基的結合或醚鍵結合來實現。疏水吸附劑作用與其他吸附劑不同，它們對組分的分離要比在相同情況下的離子交換色譜要好。其優點是對蛋白質的吸附容量較大(10～100mg/cm)，並可重複使用，效果不變，但其使用有局限性，所能達到的解析度也不高。
疏水層析的條件
① 對疏水吸附劑的選擇根據樣品特點和實驗目的選擇合適的疏水吸附劑。用一組柱，如Seph-Cn(n=1-10)，層析樣品，看樣品的吸附情況。隨著碳鏈的增長，蛋白質吸附量也增加，但洗脫條件亦隨之變得劇烈。要選擇能完全吸附目的蛋白質，但洗脫條件又比較溫和的疏水曬附劑。
② 對吸附條件的選擇為了使目的蛋白質能緊密地結合在柱床上，要選擇合適的緩衝濃離子強度和pH。上柱的樣品溶液應含有一定濃度的中性鹽，以增加目的蛋白質與疏水吸附劑的疏水相互作用。一般要在較高的離子強度(4mol/L NaCl)下吸附目的蛋白質。
③ 對洗脫條件的選擇用適當的洗脫緩衝液可以將不同的蛋白質從吸附劑上先後洗脫下來。有各種洗脫方法：降低緩衝液的離子強度；增加緩衝液的pH；加乙二醇降低洗脫液的極性；在洗脫液中加去污劑；改用低鹽析效應的鹽。上述洗脫方法，有的直接破壞疏水相互作用；有的通過改變蛋白質構象起作用。通常，用由高到低的NaCl濃度梯度洗脫，或者，由高到低的鹽濃度梯度加上由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。
疏水吸附的套用
某些低水溶性的蛋白質，如球蛋白、膜締合蛋白和其他一些在20%～40%硫酸銨飽和度時能沉澱的蛋白質，在低鹽濃度時。能被疏水吸附劑強烈地吸附，但是可以通過降低溫度、加入有機溶劑、加人多元醇(特別是1，2-乙二醇)、加入非離子洗滌劑、增加離液序列高的離子(例如硫氰酸鹽)、改變pH值等方法來削弱疏水區的相互作用，使蛋白質從吸附劑上洗脫下來。
同樣，C4、C8、C18(脂肪鏈)和苯基取代的高效液相色譜(HPLC)柱，用於純化多肽和蛋白質，也是建立在疏水吸附理論基礎上的。
這種技術已成功地用於多種酶的分離純化上，例如，用癸基或辛基的瓊脂糖柱吸附，然後用1，2-乙二醇梯度洗脫從人胎盤中分離純化葡糖腦苷脂-伊葡糖苷酶；用苯基瓊脂糖凝膠柱吸附和pH 7.6的Tris-HCI溶液遞減梯度洗脫的辦法分離純化由螢光假單胞菌產生的芳香醯基醯胺酶。
