淋巴管內皮細胞（lymphatic endothelial cells, LEC）是構成淋巴管壁的主要結構，參與維持體液平衡、調節淋巴細胞再循環和機體免疫反應等生理過程. 近年研究表明，LEC還在傷口癒合、淋巴管水腫和炎症擴散等病理過程中起重要作用，而且與腫瘤轉移密切相關[1]. 但是，由於原代分離和體外培養LEC均比較困難，國內外有關此方面的報導較少，且多集中於牛、豬等大型動物和人身上，因此大大限制了人們對LEC的認識和研究. 我們套用不完全弗氏佐劑誘導小鼠腹腔淋巴管瘤形成為細胞來源，以自制鼠尾膠作為貼黏劑培養LEC，旨在建立一個簡便、廉價和穩定的小鼠LEC培養體系.
1材料和方法.1.1材料雌性健康Balb/c小鼠10隻（第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心），4～6 wk齡，體質量（19.1±1.3） g；雄性健康SD大鼠2隻（第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心），12 wk齡，體質量（230.4±15.4） g. 含多種生長因子的EBM2培養基（英國Cambrex公司）；胎牛血清（FBS，美國HYclone公司）；不完全弗式佐劑（美國Sigma公司）；兔抗鼠VEGFR3抗體，兔抗鼠LYVE1抗體（美國Santa cruz公司）；FITC標記的羊抗兔IgG（武漢博士德公司）；3HTdR（北京原子能研究所）. 烏拉坦（1 mL/100 g）ip麻醉大鼠，剪下鼠尾，750 mL/L乙醇消毒3 min. 去皮，950 mL/L乙醇固定15 min. 抽出肌腱，750 mL/L乙醇消毒30 min，三蒸水反覆沖冼以去除殘餘乙醇. 充分剪碎，移入三角燒杯，加入5 mL/L醋酸溶液200 mL，4℃搖動過夜. 次日吸取上層液體，4000 r/min離心30 min，收集上清即為鼠尾膠. 取少量鼠尾膠加入培養瓶中（以全部覆蓋瓶底為宜），5 min後吸掉鼠尾膠，室溫放置過夜以備培養LEC之用；按同法包被下述實驗需要的培養板和製備爬片所需的蓋玻片. 按參考文獻[2]將不完全弗氏佐劑與PBS按1∶1混勻，製成乳懸液. 取8隻小鼠，ip 0.2 mL；15 d後加強注射1次. 2 mo後處死小鼠. 另設2隻小鼠注射相同體積的無菌PBS作為對照.
1.2方法打開小鼠腹腔，取出淋巴管瘤. 將其剪碎成約0.5 mm3大小，加入I型和II型膠原酶1∶1配成的1 g/L溶液5 mL，37℃恆溫搖床消化組織塊30 min，800 r/min離心10 min收集細胞，殘餘組織塊用2.5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA溶液37℃搖床消化15 min，離心收集細胞，將兩次收集的細胞混合，80 μm尼龍網過濾，台盼藍計數. 之後，將細胞接種到鼠尾膠包被的培養瓶中，使用含多種生長因子的EBM2完全培養基，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培養.
1.2.1LEC的鑑定取培養2～3代的LEC 1×106個接種於鼠尾膠包被的6孔培養板中，同時分別將鼠尾膠包被的蓋玻片置於其中. 24 h後取出蓋玻片，40 g/L甲醛固定20 min. 30 mL/L H2O2室溫封閉10 min後，再用20 mL/L山羊血清封閉20 min. 分別以兔抗鼠VEGFR3抗體或LYVE1抗體和FITC標記的羊抗兔IgG為一抗和二抗進行免疫螢光檢測，以PBS代替一抗作為陰性對照.
1.2.2LEC的增殖活力測定取培養2～3代的LEC於實驗前晚半量換液，實驗時取1×106個，以不含FBS和生長因子的培養液洗滌3次，最後將細胞懸浮於0.5 mL完全培養液中；加3HTdR 370 kBq，放入孵箱孵育3 h，每0.5 h輕搖1次；標記結束時加FBS數滴，洗去游離同位素，加完全培養液洗浴30 min，調整細胞密度2×108/L備用. 取LEC 0.25 mL/孔（5×104/孔）接種於鼠尾膠包被的24孔板，隨機分組為：①空白對照組（使用不含生長因子和FBS的EBM2培養基）；②無生長因子組（使用只含FBS的EBM2培養基）；③無FBS組（使用只含生長因子的EBM2培養基）；④完全培養基組（使用既含生長因子又含FBS的EBM2培養基）. 在孵箱中作用20 h後，低速離心5 min，輕棄上清0.1 mL；加混合酶（8 g/L胰蛋白酶與0.5 g/L DNA酶在作用前對倍稀釋而成）0.1 mL，作用30 min後，收集細胞於玻璃纖維濾紙上，烘乾後放入閃爍杯送檢cpm，換算成Bq，代表3HTdR的摻入量，反映LEC的增殖狀況. 每份設3個復孔，取其平均值計算. 另按1×104/孔接種LEC於24孔培養板，分別在1，6，12，24，48，72，96，120 h取3孔計數活細胞（4 g/L台盼藍拒染），實驗重複3 次，取其平均值，繪出生長曲線，並按公式DT=t log2/(log Nt-log No)計算其細胞倍增時間. t表示對數生長期細胞培養時間，Nt為對數生長期終末時的細胞數，No為對數生長期起始時的細胞數. 以未用鼠尾膠包被的培養孔作為對照.
1.2.3淋巴管形成試驗先將鼠尾膠鋪滿6孔培養板底部，置濃氨水棉球片刻，1 h後即形成膠原凝膠. 每孔接種1×105個LEC，補加完全培養液適量，置於37℃，50 mL/L CO2孵箱培養. 每天使用相差倒置顯微鏡觀察淋巴管樣結構形成的情況. 以未用鼠尾膠包被的培養孔作為對照.統計學處理：計量資料以x±s表示，採用統計軟體SPSS 11.0分析，組間比較用非參數秩和檢驗.
