基本介紹
- 中文名：柱層析技術
- 別稱：柱色譜技術
- 所用溶劑：二氯甲烷、 乙醚、 甲醇
- 作用：根據物質的極性分離各種混合物
簡介,技巧和方法,柱層析操作方法的選擇,柱子規格的選擇,裝柱,溶劑的選擇,上樣,淋洗液的收集和濃縮,
簡介
根據填充基質和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離蛋白質的經典層析技術。
技巧和方法
柱層析操作方法的選擇
目前，柱色譜分離的操作方式 ，主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離3種模式。常壓分離是最簡單的分離模式方便、 簡單，但是洗脫時間長。減壓分離儘管能節省填料的使用量，但是由於大量的空氣通過填料會使溶劑揮發，並且有時在柱子外面會有水汽凝結，以及有些易分解的化合物也難以得到，而且還必須同時使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動速度，縮短樣品的洗脫時間，是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵等。
柱子規格的選擇
市場上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長了 ,相應的塔板數就高 ,分離就好。目前市場上的柱子 ,其徑高比一般在1: 5～10範圍 ,在實際使用時 ,填料量一般是樣品量的 30～40倍 ,具體的選擇要根據樣品的性質和含量進行具體分析。如果所需組分和雜質的分離度較大 ,就可以減少填料量 ,使用內徑相對較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm內徑的柱子。
裝柱
柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和乾法兩種 ,濕法省事 ,一般用淋洗劑溶解樣品 ,也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等 ,但溶劑越少越好 ,不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要塗潤滑劑 ,否則會被淋洗劑帶到淋洗液中 ,可以採用聚四氟乙烯材料的閥門。乾法和濕法裝柱沒什麼實質性差別,只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ,並且一定要均勻 ,不然樣品就會從一側斜著流動。同時柱中不能有大氣泡 ,大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響 ,因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開裂 ,開裂會影響分離效果 ,甚至報廢。
溶劑的選擇
選擇一個合適的溶劑系統是柱層析分離的關鍵。在選用柱層析洗脫劑時首先要考慮三個方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、 親合性 (Affinity)和分離度 (Res oluti on)。溶劑應選擇價廉、 安全、 環保的 ,可以考慮石油醚、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙醚、 甲醇和正己烷等等。但正己烷價格較高 ,乙醚很易揮發 ,二氯甲烷和甲醇與矽膠的吸附是一個放熱過程 ,易使柱子產生氣泡。其他的溶劑用的相對較少 ,要依不同需要選擇。另外值得一提的是 ,由於我們進行的是痕量分析 ,淋洗劑的純度必須關注 ,一般使用農藥殘留級或 HPLC級的 ,如果是分析純的必須進行精製。同時溶劑在過柱後最好回收使用 ,一方面環保 ,另一方面也能節省部分經費。
上樣
用少量的溶劑溶解樣品加樣 ,加完後將底端的活塞打開 ,待溶劑層下降至石英砂面時 ,再加少量的低極性溶劑 ,然後再打開活塞 ,如此兩三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ,一開始不要加壓 ,等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (2～4 cm) ,再加壓 ,這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品在上柱前粘性較大 ,上樣後在柱上又會析出 ,這一般都是比較大量的樣品才會出現 ,是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,這樣就必須用乾法上柱了。
淋洗液的收集和濃縮
用矽膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。如果樣品與矽膠的吸附比較強的話 ,就不容易流出 ,這時可以採用氧化鋁作固定相。柱層析後的淋洗液 ,由於使用了較多的溶劑 ,必須進行濃縮 ,如果待測物具有一定的揮發性 ,最好使用常壓揮發溶劑 ,否則易導致檢測結果偏低。
