抑制性消減雜交技術

抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)技術是一種鑑定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術,其原理是以抑制性多聚酶鏈反應(PCR)反應為基礎的cDNA 消減雜交技術。

基本介紹

  • 中文名:抑制性消減雜交技術
  • 外文名:suppression subtractive hybridization, SSH
  • 概念:鑑定、分離選擇性表達基因的技術
  • 基礎:PCR反應
  • 原理:cDNA 消減雜交技術
簡介,實驗過程,

簡介

通過合成兩個不同的接頭,連線於測試cDNA 片段的5’末端,達到選擇性擴增差異性表達的cDNA 片段,抑制非目的cDNA的擴增。該技術是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基礎上建立起來的cDNA消減雜交方法,它克服了DD法的假陽性較高和RDA法消減雜交輪次較多的缺點,十分適用於克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消減雜交技術是一種以抑制性PCR 反應為基礎,將標準化測試cDNA 單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。通過合成兩個不同的接頭,接於經限制性內切酶消化後的測試cDNA 片段的5’末端,將測試和驅動進行兩輪雜交。所謂抑制性PCR 是利用鏈內退火優於鏈間退火,使非目的序列片段兩端的長反向重複序列在退火時產生“鍋柄樣”結構,無法與引物配對,從而選擇性抑制非目的序列片段擴增。

實驗過程

抑制性消減雜交技術的基本實驗過程如下。首先,將要進行比較的兩種組織或細胞來源的mRNA 樣品反轉錄為cDNA,把含有目的基因的cDNA 稱為測試(tester),把參考cDNA 稱為驅動(driver),用同一種限制性內切酶Rsa I 切割,產生末端平頭的片段,將測試cDNA 分為兩份,每份連線不同的接頭,即接頭1(adaptor 1)和接頭2(adaptor 2)。接頭為雙鏈DNA 片段,且5’- 端均無磷酸基,這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA 的5’- 末端連線,兩個接頭含有可識別的序列. 接下來進行兩次雜交。第一次雜交每個測試里加入過量驅動,然後變性、退火,根據雜交動力學第二定律,即豐度越高的分子退火速度越快,因此測試cDNA與驅動cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子,使得差異表達的單鏈分子得到富集。第二次雜交,將進行過首次雜交的兩組樣品不經變性而直接混合,只有剩下的經過消減並平均化了的差異表達的單鏈cDNA 可以重新結合為新的雜交體分子,這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2,加入新鮮變性的驅動進行第二輪消減雜交,進一步富集差異表達的雜交體分子,並用DNA 酶補平末端,這樣差異表達的測試序列- 雜交體分子5'- 和3'- 端就有了進行巢式PCR 所需的不同的退火位點。最後,進行兩次PCR 反應,第一次PCR 只有兩端連線有不同接頭的雙鏈cDNA 片段才得以指數擴增,而其他形式如一端有接頭,而另一端無接頭的只能線性擴增,沒有引物結合點的不能擴增,還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無法獲得指數擴增。利用巢式引物進行第二次PCR,富集差異表達的基因片段. PCR 產物可以被直接插入T 載體,或者利用接頭1 上的NotI/SmaI/XmaI 位點和接頭2R 上的EagI 位點進行定向克隆,或者接頭與cDNA 連線處的RsaI 位點平端克隆。然後利用測序和雜交分析來分析差異表達的序列,或者用PCR 產物作探針來篩選DNA 文庫。

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