愈傷

愈傷（callus）是指植物體的局部受到創傷刺激後，在適宜環境條件下，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源於植物體任何器官內各種組織的活細胞。愈傷的形成可減少水分蒸騰、氧化變質，還可阻止病菌侵入，從而恢復被破壞的表面保護結構。

基本介紹

• 中文名：愈傷
• 外文名：callus

基本信息

癒合組織包括受傷細胞表面栓質化或木質化，以及皮下的細胞分裂形成傷周皮組織。愈傷的形成可減少水分蒸騰、氧化變質，還可阻止病菌侵入，從而恢復被破壞的表面保護結構。農產品在採收後的各項處理中會受到多種傷害，這時受傷部分及附近細胞處於非正常狀態，而引起種種異常反應，愈傷組織的形成可使產品恢復正常的生理功能，對儲藏很有好處。完整的愈傷應該具備栓質化和形成傷周皮兩個過程，兩者的完整性和形成速度受環境條件的影響很大，在儲藏前應該創造最適宜的愈傷條件，以促使儘快形成完整的癒合組織。花卉產品表面受傷部分，在適宜環境條件下，自然形成癒合組織的生物學過程。　指植株表面受傷部分在適宜環境條件下自然形成癒合組織的生物學過程。

愈傷花卉

癒合組織包括受傷細胞表面栓質化或木質化，以及皮下的細胞分裂形成傷周皮組織。愈傷的形成可減少水分蒸騰、氧化變質，還可阻止病菌侵入，從而恢復被破壞的表面保護結構。農產品在採收後的各項處理中會受到多種傷害，這時受傷部分及附近細胞處於非正常狀態，而引起種種異常反應，愈傷組織的形成可使產品恢復正常的生理功能，對儲藏很有好處。完整的愈傷應該具備栓質化和形成傷周皮兩個過程，兩者的完整性和形成速度受環境條件的影響很大，在儲藏前應該創造最適宜的愈傷條件，以促使儘快形成完整的癒合組織。

愈傷組織類型及特徵
1.結構緻密型：表面光滑有光澤，結構緻密，多為淡黃色或白色，易於再生芽
2.結構鬆散型：多為白色，可以用於懸浮系建立
3胚性愈傷組織：具有產生胚狀體能力。
胚性發育(embryonal development) 幼胚接種到培養基上以後,仍然按照在活體內的發育方式發育,最後形成成熟胚(有時甚至可能類似種子),然後再按種子萌發途徑出苗形成完整植株,這種途徑發育的幼胚一般一個幼胚將來就是一個植株。
愈傷組織(callus) 在許多情況下,幼胚在離體培養中首先發生細胞增殖,形成愈傷組織.一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織,這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。
各種植物細胞在植物體內都處於分化狀態。要使植物細胞從分化狀態過渡到有繁殖能力的分生狀態，其細胞結構必須發生深刻的變化，否則無法完成這個過渡。這種在植物體上已分化的細胞和組織，在培養條件下逐漸恢復到分生狀態的過程，叫作脫分化。已經脫分化的細胞在一定條件下，又可經過愈傷組織或胚狀體，再分化出根和芽，形成完整植株，這一過程叫作再分化。組織培養的過程，就是植物細胞的脫分化和再分化的過程，而這一過程又是在細胞全能性的基礎上進行的，是細胞全能性發揮作用的結果。花卉產品表面受傷部分，在適宜環境條件下，自然形成癒合組織的生物學過程。

玉米愈傷組織的形成

外植體處理

首先選取飽滿、乾淨、無病蟲害侵染的成熟種子在超淨工作檯上用 ddH2O 清洗，隨後以 75%的酒精浸泡 5min。再用 0.1%的 HgCl2浸泡 10min，然後用 ddH2O 清洗 3～5 次，最後以 ddH2O 在 26℃下浸泡 48 小時。

全胚的切取

將浸泡好的玉米種子放置於高壓滅菌的大培養皿中，鑷子夾住種子，用無菌解剖刀削離出全胚，並用無菌鑷將其接於誘導培養基上盾片朝下進行誘導培養。

胚根、胚軸的切取

在超淨工作檯上將浸泡好的玉米種子沿胚軸縱切為二，用無菌解剖刀從胚中挑出培根、胚軸，胚芽用無菌鑷將其接於誘導培養基上誘導培養。

外植體培養

將已接於不同培養基的外植體置於溫度為 25±1℃的人工氣候培養箱中黑暗培養，三周左右統計愈傷組織、出芽數及出根情況。

愈傷組織繼代及分化培養

將初代愈傷組織每隔 10d 轉移到新鮮的繼代培養基繼代培養 2～3 次後，挑選出胚性愈傷組織並及時轉接於分化培養基並在溫度為 28±1℃,弱光照（白色螢光燈提供）人工氣候箱進行分化培養。

番茄愈傷組織的形成

成分; 種類	MS鹽	蔗糖	植物凝膠	抗生素; 潮黴素	抗菌素; 特美汀	激素
MS基本培養基（T0）	2.22 g	15 g	3 g	_	_	_
預（共）培養培養基（T1）	4.43 g	30 g	3 g	_	_	6-BA 1 mg/L; IAA 0.1 mg/L
分化選擇培養基（T21）	4.43 g	30 g	3 g	75 mg/L	200 mg/L	ZT 1 mg/L; IAA 0.1 mg/L
芽伸長選擇培養基（T22）	4.43 g	30 g	3 g	75 mg/L	200 mg/L	ZT 0.5 mg/L; GA 1 mg/L
生根培養基（Tr）	2.22 g	30 g	3 g	37.5 mg/L	150 mg/L	IBA 2 mg/L

無菌番茄苗的播種與獲取

超淨工作檯進行紫外殺菌20-30 min後，在酒精燈上對將要使用的鑷子及鑷子架進行高溫灼燒殺菌，之後取300顆Micro-Tom番茄種子裝入已滅菌的50 mL離心管，用75%的乙醇進行表面消毒5 min，消毒期間需不停的震盪。倒掉乙醇，用無菌水清洗1min後，再用10%的次氯酸鈉（現配現用）消毒8 min。倒掉次氯酸鈉，用無菌水清洗4-6次，每次不少於1 min。用之前灼燒過的鑷子（已冷卻到常溫），將種子均勻播種到含有MS基本培養基（T0）的培養瓶中，種子間距離以1 cm為佳（每瓶大概播種30粒）。將組培瓶置於27℃，暗培養4-5天左右，待長出1-2 cm的白色芽時，將其移到光下（光照強度2000LX，16 h/d）25℃培養3-4天左右，待莖長到5-6 cm，子葉完全伸展，真葉似見未見時可用做後續實驗。

外植體預培養

超淨工作檯紫外殺菌後，將滅過菌的濾紙放入含有預（共）培養培養基（T1）的平皿中。取滅過菌的玻璃平皿，倒入無菌水，將無菌番茄苗（子葉完全伸展，真葉似見未見）從組培瓶中取出，靠在裝有無菌水的平皿上。將無菌番茄苗的根和子葉葉尖剪除，子葉剪成1cm左右的小方形，去除生長點，分散的擺放在濾紙上。將培養皿用封口膜封住，放在暗箱內，25℃預培養2天。

農桿菌活化

用接種針沾取少許保藏於-80℃冰櫃的真核表達載體農桿菌液，在含利福平（50 mg/mL）、壯觀黴素（100 mg/L）的LB固體培養基上劃線接種，將平板倒置在28C的恆溫培養箱中，培養至長出菌落。挑取長勢較好的農桿菌單菌落接種2-5 mL含利福平（50 mg/mL）、壯觀黴素（100 mg/L）的LB液體培養基中，28℃，200 rpm小搖過夜。按1:10的比例轉接至20 mL含有相同抗生素的LB培養基中擴大培養至OD₆₀₀為0.5-0.65000 rpm常溫離心10 min，收集菌體後用無菌水重懸，使菌液OD₆₀₀在0.1-0.2之間。

農桿菌侵染外植體

超淨工作檯紫外殺菌後，將暗處預培養兩天的外植體從濾紙上取下，收集到已滅菌的玻璃皿內。將無菌水重懸的OD₆₀₀在0.1-0.2的菌液，倒入到含有外植體的皿內，侵染5 min，期間保持平皿的勻速震盪。倒掉菌液後，用無菌水清洗4-6次，每次不少於1min。將外植體重新放回到預（共）培養培養基（T1）的濾紙上。將培養皿用封口膜封住，放在暗箱內，25℃共培養2天。

外植體的抗性篩選

超淨工作檯紫外殺菌後，將暗處共培養兩天的外植體，從預（共）培養培養基（T1）的濾紙上取下，移到分化選擇培養基（T21）上。將培養皿用封口膜封住，將其移到光下（光照強度2000LX，16 h/d）25℃培養。培養一周后，應及時將外植體跟換到新的分化選擇培養基（T21）上，避免營養缺乏，防止褐變現象。

外植體的伸長培養

分化選擇培養基（T21）上的外植體由愈傷組織分化出芽時，將其從分化選擇培養基（T21）上移到芽伸長選擇培養基（T22）的組培瓶內，促進分化芽的伸長生長。由於培養基營養成分的消耗和抗生素效價的降低，芽伸長選擇培養基（T22）需要每兩周更換一次。

外植體的生根培養

當芽伸長選擇培養基（T22）上的芽生長到3-4 cm時，需要將芽轉移到生根培養基（Tr）中。在轉移時，芽必須分化出生長點，且將未分化出生長點的不定芽剪除，以減少葉片的蒸騰拉力，促進番茄芽根的分化與生長。一般情況下，3-4周可見幼根的出現，幼根生長2-3周左右即可。

轉基因番茄苗的煉苗

當轉基因番茄苗的根系發育良好時，番茄植株長到10-15 cm左右時，即可將組培瓶的蓋子逐漸擰松，過3天后將其完全打開，並加入0.5-1 cm蒸餾水在光下（光照強度2000LX，16h/d）25C煉苗2 d。

轉基因番茄苗的移栽

移栽前，要先將培養土（蛭石：營養土=1:3）分裝到花盆中，從花盆底部加水，使培養土完全濕透。煉苗後，將苗取出，洗去根部培養基殘渣，將幼苗移栽至澆足水的培養土花盆中，其上罩上塑膠薄膜，移至溫室培養。期間要不斷往托盤中加水，減少蒸騰拉力。

蕎麥愈傷組織的形成

蕎麥愈傷組織的誘導

蕎麥種子發芽後 10 天左右,選取健壯的蕎麥無菌苗,以胚軸為外植體,切成約 0.5cm的小段,每瓶均勻接種 4 小段,在 MS 固體培養基(附加 2.0mg/L 2,4-D 和 3%蔗糖)上進行愈傷組織誘導,培養條件:溫度 25±2℃,每日提供 2200lx 光照16h。

蕎麥愈傷組織的繼代培養與生長

愈傷組織誘導 2 周后,選取鮮綠色、疏鬆顆粒狀的長勢一致的愈傷組織接種到不同試驗處理組的三角瓶中。每個三角瓶內接種愈傷組織 1.0±0.1g(鮮重),平均分 4 塊均勻接種,每個處理 3 次重複(即接種 3 瓶),每 15 天繼代一次。