微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要結構生物學方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續和準確地監測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位(in situ)、線上(on-line)和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。
基本介紹
- 中文名：微熱量計技術
- 外文名：Microcalorimeter technology
- 拼音：weireliangjijishu
- 目的：提供熱力學和動力學信息
- 包括：等溫滴定量熱和差示掃描量熱
- 儀器：微量量熱儀
特點,套用,等溫滴定微量熱特點,
特點
（1）它不干擾蛋白質和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優勢，即對被研究蛋白質和核酸體系的溶劑性質、光譜性質和電學性質等沒有任何限制條件。
（2）樣品用量小,方法靈敏度高，測量時不需要製成透明清澈的溶液。
（3）量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行後續生化分析。
（4）微量熱法缺乏特異性。但由於蛋白質和核酸本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結果，這有助於發現新現象和新規律。
套用
（1）酶促反應。
（2）蛋白質去摺疊/摺疊。
（3）抗原-抗體相互作用。
（4）分子伴侶-底物相互作用。
（5）藥物-核酸相互作用。
等溫滴定微量熱特點
ITC能測量到的熱效應最低可達125nJ，最小可檢測熱功率2nW，生物樣品最小用量0.4μg，而且這些年來ITC的靈敏度得到了提高，降低了回響時間（小於10s）。ITC不需要固定或改變反應物，因為結合熱的產生是自發的。獲得物質相互作用完整的熱力學數據包括結合常數（Ka）、結合位點數（n），結合焓（△H）、恆壓熱容（△Cp）和動力學數據（如酶促反應的Km 和kcat ）。ITC也比那些選擇分析方式（如分析型超速離心法，AUC）快，一個單純的AUC實驗需要幾個小時甚至幾天去完成，而典型的ITC實驗只需30~60分鐘，在加上幾分鐘的回響時間。整個實驗有計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數（溫度、注射次數、注射量等）計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟體分析ITC得到的數據。其精確度高以及操作簡單。
等溫滴定微量熱的套用
（1）蛋白質-小分子和酶-抑制物相互作用；
（2）蛋白質-糖類相互作用；
（3）蛋白質-蛋白質相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人細胞RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙醯基轉移酶活性(Jacobsonetal.,2000)。日本Kanagawa科學技術研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小結構域識別的DNA結構及CBFβ控制的構象調整，闡明了CBFβ與CBFα間的相互作用模式及前者調控後者結合到DNA上的機制(Tahirov,etal .,2001)。
（4）蛋白質-脂質相互作用；
（5）脂質間以及脂質-小分子相互作用；
（6）核酸-小分子相互作用；
（7）蛋白質-核酸相互作用；
（8）核酸-核酸相互作用；
（9）抗體研究：美國JohnsHopkins大學生物系的生物量熱學中心是目前世界上從事生物量熱學最活躍和處於領先水平的實驗室，該中心的Freire小組(Murphyetal.,1993,1995)套用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單 克隆 抗體和酸誘導去摺疊細胞色素c與其單 克隆 抗體的結合，發現上述結合過程均為焓和熵同時驅動的反應，實驗結果表明，這些過程中溶劑釋放所導致的熵增過量補償了因結合而引起的構象熵的損失。
（10）受體相互作用；
（11）蛋白質摺疊和穩定性：如美國的Wright小組套用ITC和核磁共振(NMR)等技術研究了核激素受體蛋白的一個結構域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學，發現雖然分開的結構域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅動的，並以一種獨特的協同摺疊的機制形成螺旋異二聚體。
（12）酶分析：如Freire小組套用等溫滴定微量熱法(ITC)結合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和分光光度法研究了酵母細胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物―亞鐵細胞色素c的熱力學和動力學，並分析了原鹽效應對該酶活性的影響。我們套用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應體系，獲得了這些酶促反應的各種熱力學和動力學信息,探討了相關催化機理，同時用該法研究了博萊黴素催化切割DNA的反應，從熱力學和動力學的角度嚴格地證明了博萊黴素在催化機制上類似於DNA切割酶，但其催化效率低於DNA切割酶，並用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉磷酸化反應的熱力學，從熱力學的觀點確定了該酶促反應為快速平衡的隨機順序反應，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法―微量熱測活法。
值得指出的是，ITC不僅被套用於研究蛋白質摺疊/去摺疊，而且被套用於核酸摺疊，例如英國的Hammann等人利用ITC研究了鎂離子誘導錘頭狀核酶摺疊的熱力學，發現鎂離子與天然序列核酶的結合是一個強烈的放熱反應，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結合有很大的區別，這些工作對於核酸摺疊的熱力學研究是良好的開端。
（2）蛋白質-糖類相互作用；
（3）蛋白質-蛋白質相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人細胞RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙醯基轉移酶活性(Jacobsonetal.,2000)。日本Kanagawa科學技術研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小結構域識別的DNA結構及CBFβ控制的構象調整，闡明了CBFβ與CBFα間的相互作用模式及前者調控後者結合到DNA上的機制(Tahirov,etal .,2001)。
（4）蛋白質-脂質相互作用；
（5）脂質間以及脂質-小分子相互作用；
（6）核酸-小分子相互作用；
（7）蛋白質-核酸相互作用；
（8）核酸-核酸相互作用；
（9）抗體研究：美國JohnsHopkins大學生物系的生物量熱學中心是目前世界上從事生物量熱學最活躍和處於領先水平的實驗室，該中心的Freire小組(Murphyetal.,1993,1995)套用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單 克隆 抗體和酸誘導去摺疊細胞色素c與其單 克隆 抗體的結合，發現上述結合過程均為焓和熵同時驅動的反應，實驗結果表明，這些過程中溶劑釋放所導致的熵增過量補償了因結合而引起的構象熵的損失。
（10）受體相互作用；
（11）蛋白質摺疊和穩定性：如美國的Wright小組套用ITC和核磁共振(NMR)等技術研究了核激素受體蛋白的一個結構域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學，發現雖然分開的結構域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅動的，並以一種獨特的協同摺疊的機制形成螺旋異二聚體。
（12）酶分析：如Freire小組套用等溫滴定微量熱法(ITC)結合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和分光光度法研究了酵母細胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物―亞鐵細胞色素c的熱力學和動力學，並分析了原鹽效應對該酶活性的影響。我們套用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應體系，獲得了這些酶促反應的各種熱力學和動力學信息,探討了相關催化機理，同時用該法研究了博萊黴素催化切割DNA的反應，從熱力學和動力學的角度嚴格地證明了博萊黴素在催化機制上類似於DNA切割酶，但其催化效率低於DNA切割酶，並用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉磷酸化反應的熱力學，從熱力學的觀點確定了該酶促反應為快速平衡的隨機順序反應，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法―微量熱測活法。
值得指出的是，ITC不僅被套用於研究蛋白質摺疊/去摺疊，而且被套用於核酸摺疊，例如英國的Hammann等人利用ITC研究了鎂離子誘導錘頭狀核酶摺疊的熱力學，發現鎂離子與天然序列核酶的結合是一個強烈的放熱反應，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結合有很大的區別，這些工作對於核酸摺疊的熱力學研究是良好的開端。
