《基於化學修飾的高效10-23脫氧核酶類似物的發現》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由何軍林擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於化學修飾的高效10-23脫氧核酶類似物的發現
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：何軍林
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
10-23脫氧核酶是一個具有專一性催化裂解底物RNA的DNA分子，被廣泛研究作為抗腫瘤、抗病毒等的基因治療候選藥物。但它的不足之處是細胞內的Mg2+濃度不足以發揮它的快速裂解mRNA的能力，而目前對於10-23脫氧核酶的化學修飾未能提高其催化效率。我們著眼於它的催化結構域的9個嘌呤鹼基的五員環部分，即9個7位氮原子與其它功能基之間的相互作用可能對反應發生重要的影響，提出從微小的擾動到功能基引入的逐步化學修飾策略，利用多種核苷類似物研究9個7-位氮原子對於脫氧核酶的重要性，它在五員環的位置變化和羥基、氨基、咪唑基等的引入等對脫氧核酶催化速率的影響，發現能提高催化效率的化學修飾方式，包括在催化結構域中的修飾位點的選擇和用於修飾的核苷類似物兩個方面。我們的前期工作表明了這一策略的可行性，預期將獲得催化速率高10倍以上的10-23脫氧核酶類似物，降低對Mg2+的依賴性，獲得作為基因治療的候選藥物。
結題摘要
10-23脫氧核酶是一個具有催化裂解互補底物RNA的DNA分子，它由兩端的識別結構域和一個催化結構域組成。識別結構域以專一性鹼基配對的方式識別底物，由催化結構域實現對底物的剪下，因此，它具有作為基因治療藥物和基因分析工具的巨大潛力。由於催化結構域構象未知，隨機修飾成為唯一的途徑，但少有提高活性的報導。我們推測在催化結構域的15個鹼基都以功能基成氫鍵的方式，以環平面作為支撐骨架結構，構成催化活性構象，因此，我們的修飾策略是基於功能基水平的修飾。9個嘌呤鹼基有一個共同的結構因素是7-氮原子，以此為出發點，在9個嘌呤位點分別實施單個功能基突變，從7-位氮原子的消除到該氮原子轉移到8-位，再進一步在7位引入多種蛋白質活性功能基，實現從結構微擾到功能基引入，獲得提高催化反應速率的途徑。以8-氮-7-去氮-2’-脫氧嘌呤苷引入的7-位取代基的性質和對於催化活性的影響來看，在A9，G2，G14位都提高了脫氧核酶的催化速率，而且，成氫鍵能力強和空間占據大的功能基，對於催化構象的最佳化能力更大，在A9位：氨基 ＞ 羥基 ＞ 叔丁基苯基 ＞ 苯基 ＞ 氫原子，咪唑基 ＞ 苯基；在G2和G14位，氨基 ＞ 羥基 ＞ 戊基 ≈ 氫原子。其中，7-胺丙基-7-去氮-8-氮-2’-脫氧腺苷在A9位的取代（脫氧核酶DZ21）獲得了9倍催化速率的提高，催化效率也得到了提高；獲得了針對腺嘌呤和鳥嘌呤修飾的兩個先導化合物和脫氧核酶的兩個先導結構。如此明確的構效關係也說明，10-23脫氧核酶的催化結構域在二價金屬離子如Mg2+的幫助下，形成了一個相對剛性的催化構象。 利用pH，金屬離子的濃度和種類對於催化反應的影響，機制研究表明化學修飾並未影響脫氧核酶的催化機制。我們推測所引入的功能基以成氫鍵或空間擁擠的方式使催化構象得到了最佳化。這對於我們利用別的方法來解析結構是一個很有益的提示。 更重要的是，修飾脫氧核酶的高催化效率是其內在的性質，不隨底物序列而變化。針對兩種底物片段（血管內皮生長因子受體II和HIV-1的保守基因片段vpr-），以及在識別結構域的硫代修飾對於催化速率的提高沒有影響。 本課題設計合成了17個核苷類似物和它們的亞磷醯胺單體，合成了62個脫氧核酶序列，完成了全部結構鑑定工作，超出課題最初設計的10個化合物和45個脫氧核酶，加強了課題研究的科學性和邏輯性。
