基本介紹
- 中文名：創傷植物感染法
- 外文名：Wound infection method
- 菌種：農桿菌
- 方法：共培養法、葉盤法等
- 也叫：整株感染法
- 例子：擬南芥
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農桿菌介導法
農桿菌介導法(Agrobacterium-mediated transformation)屬於載體介導法，包括根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導法和髮根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）介導法，是利用農桿菌中農桿菌Ti質粒或Ri質粒做為基因轉化載體，將外源基因導入植物細胞，並切割整合到植物染色體上從而完成轉化。與其它轉化方法相比，農桿菌介導法獲得穩定轉化體的頻率高且重複性好。農桿菌介導法是目前機理最清楚、技術最成熟、使用最多、成功實例最多的轉化系統，也是植物基因工程中最重要的一種轉化系統。雖然農桿菌對單子葉植物，特別是禾本科植物不敏感，但絕大多數的果樹是雙子葉植物，對農桿菌比較敏感，因而農桿菌介導法是果樹遺傳轉化的主要方法。木本果樹轉化成功的例子中，80%以上是採用農桿菌介導法。
農桿菌轉化果樹的方法有葉盤轉化法、體細胞胚或胚性細胞的轉化及整體植株接種共感染法等。在1985年，Horsch等發展起了葉盤轉化法(leave dish transformation)，之後又廣泛用莖段、葉柄、胚軸、子葉等離體材料的進行轉化。已先後在蘋果、柑桔、獼猴桃、柿、草莓等多種果樹上獲得轉化植株。雖然葉盤法操作簡單，適應性廣且重複性高，但轉化周期長，工作量大。轉化時是否採用葉盤法主要決定於外植體的再生能力。作為植物遺傳轉化操作中的基木受體系統的胚性細胞，由胚性細胞發育而來，其具有很強的接受外源DNA的能力，且獲得的轉基因植株中嵌合體少，轉化效率高，而且體細胞胚具有兩極，可同時分化出根和芽。套用體細胞胚作為受體系統進行轉化的有核桃、黑核桃、番木瓜等。不過對於大多數林果樹來說，成功得誘導出體細胞胚胎比較困難，因而僅局限在少數果樹上套用。整體植株接種共感染法一般採用無菌的種子實生苗或試管苗作為外植體，在植株上造成創傷，直接接種農桿菌，或用針頭把農桿菌注射到植株體內，使農桿菌在植株體內進行侵染實現轉化。雖然這種方法具有較高的轉化成功率，但是容易產生嵌合體。套用植株接種共感染法在蘋果砧木M26、龍眼、柑桔等果樹上取得了成功。
農桿菌轉化的載體系統
Ti質粒是植物遺傳轉化的天然載體，它的一個重要性質就是在發生侵染後可以將T-DNA上攜帶的基因整合到植物的染色體中，並且在染色體上穩定存在，遺傳信息可以傳遞到子代細胞中。
野生型的Ti質粒大約200kb左右，包括T-DNA區（transfer-DNA region)、vir區(virulence region)、con區(region encoding conjugations)、ori區（origin of renlication)。
農桿菌介導植物遺傳轉化的過程及方法
農桿菌轉化植物細胞的過程是一個複雜的過程，由細菌和植物細胞發生相互作用，具有真核生物和原核生物轉化表達的雙重特點。
農桿菌在植物的傷口處附著後，受傷的植物組織被誘導釋放一種酚類化合物（如AS等），誘導Ti質粒Vir區基因的表達。Vir區基因表達的產物與T-DNA作用產生T-DNA鏈，並以DNA-蛋白複合體的形式轉移進植物細胞核中。T-DNA轉移至宿主細胞核後，在宿主細胞染色體上隨機整合，隨後起始在植物細胞內的轉錄和翻譯，使外源基因得到表達，改變細胞的表型。
利用農桿菌將外源基因導入植物受體細胞中，目前研究比較多的主要有共培養法、葉盤法和創傷植物感染法。
共培養法
1979年，Marton等首次報導了共培養法的使用。將原生質體與農桿菌進行共培養具有較高的轉化效率，但是操作比較複雜，要求的原生質體的質量比較高，因此在許多重要作物中的套用受到了限制。
葉盤法
1985年Horsch等建立葉盤法，大大推動了農桿菌介導遺傳轉化技術的套用。但是在一些難以再生葉片的植物中仍然無法得到很好的轉化。
創傷植物感染法
用除去致瘤基因的農桿菌直接感染生長植物葉片或嫩芽頂端的傷口，激素誘導枝條分櫱後，檢測枝條即可獲得轉化植株，這種方法叫做創傷植物感染法，也叫整株感染法。整株感染法具有其自己獨特的優勢，但是目前僅在擬南芥中得到報導（李衛等，1997）。
農桿槍法
後來又出現了一種新的轉化方法“農桿槍法”（Agrolistic）。表達的Vir區段的基因能在植物細胞內切割保守序列的DNA並轉入T-DNA，轉化效率約占20%（HansenG，1996）。1999年Ziemienowicz等人利用該方法，有效地將目的基因導入到哺乳動物的細胞核中得到表達。該方法綜合了農桿菌轉化法和基因槍法的優點，宿主細胞廣泛，因而極具發展前途。
近些年來，一些科學家還嘗試通過使用抗氧化劑、微創傷處理受體細胞、乾燥處理、使用表面活性劑、插入核基質附著序列等輔助方法，來促進農桿菌向一些較難轉化植物中的轉化。
農桿菌在受體細胞表面的附著是二者相互作用的關鍵，因此一個合適的接觸環境對農桿菌的進入十分重要（Amoah等，2001）。通過超音波和負壓輔助處理受體植株形成微創傷，有利於農桿菌進入受體細胞中。但是處理過程中要注意微創口不能太大，會影響轉化植株的正常生長；也不能太小，否則將達不到應有的效果。1999年Trick等人建立了超音波輔助農桿菌轉化技術（sonication-assisted agrobarterium-mediated transformation，SAAT），首次在農桿菌介導遺傳轉化過程中套用超音波技術，獲得了較好的結果。2008年，畢瑞明在農桿菌侵染切傷的小麥成熟胚時，用注射器進行負壓處理，結果也證明小麥成熟胚的轉化效率比普通法高（畢瑞明，2008）。
在植物受到逆境脅迫時，植物細胞會產生過氧化物，抑制細胞的正常新陳代謝（DanY等，2009），影響轉化植株的再生。因此通過向培養基中添加一些抗氧化劑（如AgNO3、DTT、PVP、GB、GSH等），能去除農桿菌侵染時產生的活性氧，促進轉化植株的再生（DanY等，2008）。
表面活性劑可以作為一種滲透劑，使細胞膜變得敏感，也可以通過減小表面張力，促進農桿菌與受體細胞的親和，提高轉化效率。1998年Clough等通過表面活性劑Silwet-77，提高了轉化效率。
核機制附著序列（matrix attachment regions，MAR）與T-DNA在植物細胞內穩定、轉運和整合有關，因此可以通過在表達載體上插入這樣一段序列來促進農桿菌介導的遺傳轉化。2009年zhang等就從菸草中分離出一個新的MAR，命名為TM2，並通過實驗證明了TM2可以提高目的基因在水稻和菸草中的表達水平（zhang等，2009）。
