《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》是南京林業大學於2008年6月30日申請的專利，該專利的申請號為2008101243857，公布號為CN101338342，授權公布日為2009年1月7日，發明人是黃麟、葉建仁、吳小芹。
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》公開了一種松材線蟲檢測試劑盒，它是以5’ACC ATT CGG TTG GCT CTGTT 3’為正向引物（F），5’CCC TAA GGC GTC GGT GAA C 3’為反向引物（R），5’FAM－TAG CTG AGC ATC TTT T－TAMRA 3’為螢光探針（P）。該發明還公開了採用該試劑盒檢測松材線蟲的方法。該發明的松材線蟲檢測試劑盒中的引物和探針具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為松材線蟲的檢測提供了快速、靈敏、特異的方法。
2016年12月7日，《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法
- 公布號：CN101338342
- 授權日：2009年1月7日
- 申請號：2008101243857
- 申請日：2008年6月30日
- 申請人：南京林業大學
- 地址：江蘇省南京市龍蟠路新莊9號
- 發明人：黃麟、葉建仁、吳小芹
- Int.Cl.：C12Q1/68(2006.01)；G01N21/64(2006.01)
- 代理機構：南京蘇高專利商標事務所
- 代理人：柏尚春
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
松材線蟲病[Bursaphelenchu xylophilus（Sleiner&Buhrer）Nickle]，又稱為松樹萎蔫病，由松墨天牛（Monochamus alternatusHope）傳播，主要造成松樹萎蔫，可在短時間內導致松樹死亡，是松樹的一種毀滅性病害。寄主包括黑松（Pinusthunbergii）、赤松（P.densiflosa）和馬尾松（P.massoniana）在內的數十種松屬植物，也危害少數非松屬針葉樹。日本1905年首次報導了該病，截至2008年6月，已分布於美國、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韓國、日本及中國等多個國家，其中在日本、中國和韓國發生最為嚴重。中國自1982年在南京中山陵首次發現該病，短短的20年時間裡，疫情已擴大到江蘇、安徽、廣東、浙江、山東、福建、江西、廣西、四川、雲南、上海、台灣和香港等16個省區，發生面積達10萬平方公頃，累計致死松樹3500多萬株，直接經濟損失25億元，間接損失250億元。疫情擴散蔓延呈加劇之勢，截至2008年6月，已逼近黃山等著名風景名勝區、世界自然文化遺產和重點生態區域，並已對中國大面積松林構成了嚴重威脅，是中國最具危險性的頭號森林病蟲害。但到針對該病還沒有一種確實有效的防控措施。造成該病遠距離、大面積、快速傳播的主要因素系人為傳播，即人為運輸疫木及木製品造成的。因此，加強對松材線蟲病的檢驗檢疫，防止其遠距離傳播是治理松材線蟲病工作的主要任務之一。準確診斷松材線蟲病具有重要意義。
截至2008年6月，松材線蟲的主要檢疫技術是形態學觀察，但形態學觀察存在以下不足：第一，松材線蟲與其同屬的其他幾種傘滑刃線蟲之間非常相似。比如，松材線蟲與其近緣種擬松材線蟲（B.mucronatus）的主要形態學區別在於擬松材線蟲的雌成蟲有一大約3.5微米左右的尾尖突。由於類似的在形態特徵上，松材線蟲與其他線蟲的重疊現象，給準確鑑定帶來很大難度。第二，由於自然界的線蟲種類豐富多樣、線蟲蟲體微小，要準確鑑定某種線蟲需要專業的技術知識和技能，因此在實際檢測過程種，經常存在錯檢、漏檢情況。第三，各檢疫檢查站、檢疫口岸截獲的一些松木原木、木質包裝材料等，由於含水量較少，線蟲含量較少，且大多為幼蟲，形態學上很難準確鑑定。而為了獲得可用於形態鑑定的成蟲，一般需培養7-10天，滿足不了檢疫部門快速檢疫的要求。
由於形態鑑定的不足，現已有不少學者從遺傳學、免疫學、病理學和生理生化等方面試圖建立針對該病的快速檢測技術，這些技術方法都在一定程度上豐富了松材線蟲的檢測手段。但這些方法在檢測過程中，由於受到線蟲的發育階段、寄主、立地條件以及實驗條件等方面造成的差異和限制，在套用的過程中都有一定的局限性。因此，開展松材線蟲的分子檢測技術，特別是準確、快速、易於掌握的檢測技術，對有效控制該病的進一步蔓延和擴散具有重要意義。
截至2008年6月，在松材線蟲的分子檢測方面，主要可分為兩大類，一類是傳統PCR的方法，譬如，南京農業大學的專利“松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法”（申請號：200310106109.5）、雲南農業大學的專利“一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速的檢測方法”（申請號：200510048722.5）和葉建仁等的專利“松材線蟲PCR檢測特異引物對”（申請號：200610039049.3），以上方法都具有所需儀器設備較多，樣品處理複雜，實驗環節偏多，不易掌握，容易帶入人為誤差等特點。另一類是實時螢光PCR的方法，如中國科學院微生物研究所的專利“一種檢測松材線蟲的方法及其專用引物和探針”（申請號：200310109374.9），以及上海市林業病蟲防治檢疫站和南京農業大學植物保護學院的專利“松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法”（申請號：200510026710.2），由於以上檢測方法所用的引物和探針都來自核糖體rDNA和微衛星DNA，這些DNA序列都極度保守，因而可能導致引物的特異性、穩定性不足。
發明內容
專利目的
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》所要解決的技術問題是提供一種能準確、快速、靈敏、結果易於判讀的松材線蟲檢測試劑盒。
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》還要解決的一個技術問題是提供採用上述試劑盒檢測松材線蟲的方法。
技術方案
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》所採用的技術方案如下：
一種松材線蟲檢測試劑盒，它包括如下成分：
（1）松材線蟲DNA模板和擬松材線蟲對照DNA模板；
（2）松材線蟲特異性引物對和探針
正向引物（F）：5’ACC ATT CGG TTG GCT CTGTT 3’
反向引物（R）：5’CCC TAA GGC GTC GGT GAA C 3’
螢光探針（P）：5’FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3’
（3）5微升Taqman 2×PCR Master Mix；
（4）線蟲裂解液：50毫摩爾每升KCl，10毫摩爾每升Tris.Cl，pH8.3，2.5毫摩爾每升MgCl2，0.45％（v/v）NP40，0.45％（v/v）Tween20，80微克/毫升ProteinaseK。
採用上述的試劑盒檢測松材線蟲的方法，包括如下步驟：
（1）取線蟲樣本於20微升的線蟲裂解液中，65℃處理1小時，95℃處理10分鐘，16,000克離心1分鐘，取2.5微升上清用於實時PCR檢測；
（2）PCR反應體系為：5微升Taqman2×PCRMasterMix、0.5微升正向引物（F）、0.5微升反向引物（R）、0.5微升螢光探針（P）、2.5微升上清液模板、1微升去離子水；
（3）上述PCR反應體系於7500PCR儀（AppliedBiosystems）上按以下程式進行PCR反應：50℃2分鐘，95℃10分鐘，進入循環95℃15秒，55℃33秒，72℃33秒，共40個循環；設定在72℃延伸步驟收集螢光信號；
（4）判斷結果：待測樣品產生螢光增長曲線，說明該樣品為松材線蟲；反之則不是松材線蟲。
有益效果
由於《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》用的引物和探針來自不同物種中高度保守的Topoisomerase基因的內含子區域，採用該引物對和探針能準確、快速、方便的判別線蟲樣本、病疫木中是否含有松材線蟲，靈敏度達0.01納克模板DNA；該方法能檢測包括線蟲卵在內的松材線蟲所有發育階段的松材線蟲；同時克服了形態學鑑定中對線蟲發育階段的限制；同時也克服了傳統上利用松材線蟲的rDNA設計引物進行常規PCR和實時PCR檢測，可能造成由於引物、探針的極度保守性而出現的檢測特異性不足的問題；同時還克服了由傳統PCR檢測手段帶來的操作複雜、技術性強、耗時長、造成環境污染等方面的不足。
附圖說明
圖1利用引物對TOPO-F/R和探針TOPO-P檢測不同線蟲結果。
圖2利用引物對TOPO-F/R和探針TOPO-P靈敏度檢測結果。其中，100納克，10納克，1納克，0.1納克，0.01納克分別表示不同濃度的松材線蟲提純DNA；NTC表示空白對照。
圖3利用引物對TOPO-F/R和探針TOPO-PB檢測不同發育階段單條線蟲結果。其中，100納克表示100納克松材線蟲提純DNA；Egg，L-2，L-3，L-4表示卵，2齡，3齡，4齡松材線蟲幼蟲；F表示松材線蟲雌成蟲；M表示松材線蟲雄成蟲；B.mucronatus表示擬松材線蟲對照。
技術領域
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》屬於植物保護和質檢領域，涉及一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法，尤其涉及一種松材線蟲實時螢光PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
權利要求
1、一種松材線蟲檢測試劑盒，其特徵在於，它包括如下成分：
（1）松材線蟲DNA模板和擬松材線蟲對照DNA模板；
（2）松材線蟲特異性引物對和探針
正向引物（F）：5’ACC ATT CGG TTG GCT CTGTT 3’
反向引物（R）：5’CCC TAA GGC GTC GGT GAA C 3’
螢光探針（P）：5’FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3’
（3）5微升Taqman 2×PCR Master Mix
（4）線蟲裂解液：50毫摩爾每升KCl，10毫摩爾每升Tris.Cl，pH8.3，2.5毫摩爾每升MgCl2，0.45％（v/v）NP40，0.45％（v/v）Tween20，80微克/毫升ProteinaseK。
2、採用權利要求1所述的試劑盒檢測松材線蟲的方法，其特徵在於它包括如下步驟：
（1）將線蟲放入20微升的線蟲裂解液中，65℃處理1小時，95℃處理10分鐘，16,000g離心1分鐘，取2.5微升上清用於實時PCR檢測；
（2）PCR反應體系為：5微升Taqman2 ×PCR Master Mix、0.5微升正向引物（F）、0.5微升反向引物（R）、0.5微升螢光探針（P）、2.5微升上清液模板、1微升去離子水；
（3）上述PCR反應體系於7500PCR儀上按以下程式進行PCR反應：50℃2分鐘，95℃10分鐘，進入循環95℃15秒，55℃33秒，72℃33秒，共40個循環；設定在72℃延伸步驟收集螢光信號；
（4）判斷結果：待測樣品產生螢光增長曲線，說明該樣品為松材線蟲；反之則不含有松材線蟲。
實施方式
- 實施例1：引物和探針的設計
《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》在構建松材線蟲和擬松材線蟲抑制消減雜交的基礎上，獲得了松材線蟲中特異表達的Topoisomerase基因片段。
ACACTGAAGACTTTAAGAACCGCGAAATGAGAATAAGACAGCGCGCTGTGGCCCT
ATATTTCATCGACAAGCTGGCTCTGAGAGCGGGAAATGAGAAAAAAGTGGACAGGCT
CAAGGAACAGCTGAAGAGGCTGAAGATTCAAAGAACGGATAAGGACGAAAACAA
ACAAATCGCTCTCGGCACCTCCAAACTCAACT
根據以上序列設計引物XC64F（5’TGGCC CTATATTTCATCGACAA3’）和XC64R（5’TCCTTGAGCC TGTCC ACTTTT3’），並用該引物對松材線蟲的基因組DNA進行擴增，獲得該基因的內含子，序列如下：
TGGCCCTATATTTCATCGACAAGCTGGCTCTGAGAGCGGGAAATGAGAAAGATACG
GACGAAGCGGCCGATACTGTGGGTTGTTGCTCGCTGAGATGCGAACATGTCACTTT
GAACGAGGAATTGGACGGAAAAAAGTAGGAATTTTGGCTTAAAGTCATCTATTTTA
TATTGATTTAGGCATATGTTTTTGATATAAAAAATTTTTTTTTTCAGATATGTCGTGGA
ATTCGACTTCCTGGGTAAGGATTCAATCCGATACTACAACAAGGTCCCGGTTGAAA
AGCAAGTGTTCAAAAATTTGAAAATTTTCAAGGAAGACAAGGAACCTGGAGATGA
TCTTTTCGATCGATTGGATGTAAGTTTTTGGGGAAAAATGTGGTTTTTAGGGGCTGA
AATGGGATTCGTACTGCTTATAAGGGCCTAAAGTGGAATTATTTTTGATCTGGAGAG
TATTAAATGGGATTAAATGAGATATGTTGATCCTGAAACAGGCTAAAATAAGGTTGA
TTTTGCTTGAAATTACATAAAATAAGGGTTTTGGAGCTTGGAACAGTCTAAAATAG
GGTGAATTGTTTTAAAAACGACCTAAAATAAGGTCAGTTTGCTAGAAATTACGTAA
AATAATGGCCTAAAACAGTCTCAAATAAGGTGCATTGTTTTTAAAAATTGCCTAAAA
TGGGGTTCTTTTACATAATTTGGATCTAATGTCATCTCTTTTCCCCACTTCAGACGTC
CACTCTGAACTCACATCTCCGCTCACTGATGCCCGGCCTCACGGCCAAGGTGTTCC
GTACCTACAACGCCTCCATCACCCTTCAAAATCAGCTGGAAGAACTGACCAACCCT
AAGGCGTCGGTGAACG CAACAGAGCCAACCGAATGGTCGCCG
TGCTGTGTAACCATCAACGGGCCGTCCCGAAGACGCACGAAAAGTCGATGGAAAA
TTTGGAAAACAAAATCAAGGACAAGAAAACGGAGCTGAAGGAAGCCAAGCTGGC
CCTGGAGAAGGCCAAGGGAAAGGACAAGGAAAAGGCCGAGAAAAAAGTGGACA
GGCTCAAGGA
根據內含子序列設計用於實時螢光PCR的引物對TOPO-F（5’ACC ATT CGG TTG GCT CTGTT 3’）/TOPO-R（5’CCC TAA GGC GTC GGT GAA C 3’）和探針TOPO-P（5’FAM-TAG CTG AGC ATC TTT T-TAMRA3’）。
將以上引物對和探針用於松材線蟲的實時螢光PCR檢測。
- 實施例2：松材線蟲的檢測
1、線蟲DNA提取
分別收集的線蟲樣本（見表1）於20微升的線蟲裂解液中（50毫摩爾每升KCl，10毫摩爾每升Tris.Cl，pH8.3，2.5毫摩爾每升MgCl2，0.45％（v/v）NP40，0.45％（v/v）Tween20，80微克/毫升ProteinaseK），65℃處理1小時，95℃處理10分鐘後，16,000克離心1分鐘，取2.5微升上清用於實時PCR檢測。
2、實時PCR檢測
在實時螢光PCR反應管中，加入5微升Taqman2×PCRMasterMix（AppliedBiosystems）、0.5微升TOPO-F（10微摩爾）、0.5微升TOPO-R（10微摩爾）、0.5微升TOPO-PB（10微摩爾）、2.5微升上清液模板、1微升去離子水。
將反應混合液置於實時螢光7500PCR儀（AppliedBiosystems）反應孔上，按以下程式進行PCR反應：50℃2分鐘，95℃10分鐘，進入循環95℃15秒，55℃33秒，72℃33秒，共40個循環。設定在72℃延伸步驟收集螢光信號。
3、結果判讀
反應結束後，待測樣品產生螢光增長曲線，說明該樣品為松材線蟲；反之則不是松材線蟲。編號1～6為松材線蟲；7～9為擬松材線蟲；10-11為其他線蟲；由圖1可見只有松材線蟲有陽性擴增信號，其他線蟲和空白對照均無陽性擴增信號。《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》方法靈敏度檢測結果見圖2。《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》方法對不同發育階段單條線蟲的檢測結果見圖3。由圖1、圖2和圖3可知，《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》方法特異性好，靈敏度高，且對不同發育階段單條線蟲都具有較好的檢測效果。
表1供試中國松材線蟲線蟲來源
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
