DDRT-PCR，是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構。因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創始人Liang P和Pardee A根據Poly A序列起點前2個鹼基除AA外只有12種可能性的特徵，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出200條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑑定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。
基本介紹
- 中文名：傳統mRNA差異顯示技術
- 外文名：DDRT-PCR
- 創始人：Liang P和Pardee A
- 優點：速度快，較易操作等
簡介,發展歷史,
簡介
傳統mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，
發展歷史
mRNA 差別顯示技術（DDRT-PCR ）隨著PCR技術的發展，人們在此基礎上建立起了一系列基於基因分離的新技術新方法。如mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR ）、以及進一步改進的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除雜交（SSH）和互動扣除RNA 差別顯示技術（RSDD）。
差別顯示PCR是根據絕大多數真核細胞mRNA 的3′端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA 反轉錄成cDNA。該方法的創始人Liang P和PardeeA根據Poly A序列起點前2個鹼基除AA外只有12種可能性的特徵，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5′-T11MN；同時為擴增出polyA上游500 bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10 bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA 條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA 類型，這一數字大體涵蓋了在一定發育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。回收不同組織所特有的差別表達條帶中的DNA ，再擴增至所需含量，進行Southern blot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑑定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。
mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR ）與示差篩選、扣除雜交相比，具有很多優點：①速度快，較易操作；②由於PCR擴增技術的套用，使得低豐度mRNA 的鑑定成為可能，且靈敏度高，③可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。
儘管差別顯示技術有以上諸多方面的優點，但在實際操作中仍存在一些問題，主要表現在：①出現差別條帶太多，假陽性率高達70%左右，重複性差，且對高拷貝數的mRNA 具很強的傾向性；②擴增條帶分子長度較短，一般在110-450bp之間。
