CPG Frits

CPG （Controlled Pore Glass）Frits：含可控孔徑的玻璃球的濾芯，是CPG與UHMW-PE（超高分子量聚乙烯）或HDPE（高密度聚乙烯）粉末燒結而成。是深圳逗點生物技術有限公司的專利技術。第二代CPG 合成柱Embed™ DNA通用合成柱 ,把用於DNA合成的CPG鑲嵌到篩板中，使合成溶劑流道固定，流動相在CPG內部的孔和UHMW-PE顆粒之間的孔中流動，完成各種化學反應。大大提高了合成產物的純度。合成的引物不經過純化就能直接用於定量PCR實驗。

基本介紹

• 中文名：含可控孔徑的玻璃球的濾芯 
• 外文名：CPG Frits
• 孔徑：500Å-1000Å
• 套用：DNA合成

套用背景

隨著分子生物學技術的發展，包括藥物研發、遺傳病和感染性疾病診斷、基因研究、聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交試驗都需要大量的DNA片段，這些DNA片段大都需要人工合成。DNA合成的片段常常有不同的表述方法，比如寡核苷酸、PCR引物、接頭、探針、短鏈引物和長鏈引物等。

DNA合成過程簡述如下:

第一步是將預先連線在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。

第二步，合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少於2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這種短片段可以在後續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連線到固相載體（通常是CPG）的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過氨水高溫處理，連線在CPG上的片段被切下來，通過OPC、PAGE等手段純化片段，成品片段用C18濃縮，脫鹽，沉澱。沉澱後的片段用水懸浮，測定OD260定量，根據要求分裝。

產品材質

CPG（Controlled Pore Glass）微孔玻璃小球，二氧化矽材質，現在被廣泛用作固相合成寡核苷酸的支持。CPG球體內部有很多不規則的孔道，孔隙網路龐大，孔道的大小稱為孔徑，孔徑穩定，一般選擇孔徑500Å和1000Å的CPG用於DNA合成，也可以選擇其它孔徑。由於空間原因，孔徑大的適用於長片段的合成，孔徑短的適合短片段合成。

結構與套用

用作合成DNA的CPG上一般會耦合上有化學基團的連線臂（linker），用來連線DNA合成過程中的A、T、C、G鹼基單體。生產CPG 的公司，連線臂的設計有所不同，直接影響DNA的合成產量。篩板（Frit）通常用UHMW-PE（超高分子量聚乙烯）或HDPE（高密度聚乙烯）粉末燒結而成。UHMW-PE粉末在一定的溫度下處於半融化狀態，顆粒之間搭橋形成一定的孔徑。第一代CPG 合成柱是由2塊篩板，中間填充CPG而成，類似三明治的結構。有四種顏色，分別用來合成A、T、C、G四種鹼基。篩板的作用是阻擋CPG不漏下來而合成試劑能夠通過。空柱管為聚丙烯注塑而成。深圳逗點生物技術有限公司第二代CPG 合成柱Embed™ DNA通用合成柱 ,把用於DNA合成的CPG鑲嵌到篩板中，使合成溶劑流道固定，即CPG Frits是CPG和UHMW-PE或HDPE粉末燒結成，專利技術。只有一種，為通用合成柱。UHMW-PE顆粒包裹並固定CPG顆粒，UHMW-PE顆粒之間搭橋形成一定的孔徑。流動相在CPG內部的孔和UHMW-PE顆粒之間的孔中流動，完成各種化學反應。大大提高了合成產物的純度。合成的引物不經過純化就能直接用於定量PCR實驗。此合成柱適用於主流DNA合成儀，如ABI3900，MerMade192，Dr. Oligo192，Oligo Maker 192 等。

產品特點

和第一代的DNA合成柱比較，Embed™ CPG Frits合成柱是一個進步，主要表現在以下幾個方面：

1、高效率，純度更高，突變率更低。第一代的合成過程，試劑進入CPG孔隙主要靠滲透作用，效率很低，時間較長。每個步驟加試劑的動作，會使CPG不斷旋轉，降低了合成試劑在孔隙中流動的效率。深圳逗點生物技術有限公司的嵌合技術使合成溶劑流道固定，試劑和linker接觸更穩固，反應更充分，清洗更徹底，每個合成步驟更高效，提高了合成產物的純度，突變率更低。在大多數情況下，合成的引物不經過純化就能直接用於後續實驗。

2、節省合成試劑，更環保。經典的第一代DNA合成柱容納試劑的空間較大，而第二代Embed™ CPGFrits只有孔隙的體積是容納試劑的體積。當試劑流過時，第一代是通過滲透作用到達CPG孔的內部與外部，試劑耗損率大，第二代是固定通道，大大節省了試劑，保護了環境。深圳逗點生物技術有限公司Embed CPGFrits最佳化了設計，體積進一步減小。

3、合成總體成本低。Embed™ CPG frits要節省30%-50%的成本。在試劑（尤其是單體）耗損上，第二代CPGFrits比第一代產品要少；進一步降低試劑損耗需要降低CPG的使用量。我們發現在微克的水平要把CPG分配均勻非常困難，批內和批間差異很大，低規格LOADING值很難通過減少CPG用量來實現。第二代CPGFrits很好解決了這個問題。

4、提高可靠性，減少出錯機率。第一代產品分為A\T\C\G四種，第二代為通用合成柱，用Universallinker，只有一種，庫存上，第二代減少4倍，且操作上，不會因區分顏色而產生出錯率。

5提高合成速度，節省了總體時間。深圳逗點生物技術有限公司Embed™CPGfrits，在第一個循環去掉了DMT的保護，從而減少了這一步驟的反應時間，提高了合成速度。且Embed™CPGfrits，由於體積小，能夠將CPG含量降到最低，僅為0.5-1mg，偶合時，單體用量僅為15-20µL，耦合時間在30秒內完成，從而縮短了整個合成的時間。合成的引物不經過純化就能直接用於後續實驗，也大大節約了總體時間。

6、超強的疏水環境，保護合成過程。DNA合成需要在無水環境進行。深圳逗點生物技術有限公司的Embed™CPGfrits使用的UHWM-PE，具有極強的疏水性，CPG被包裹其中。DNA合成過程中，試劑不能接觸水，UHWM-PE材質的使用無疑能使合成效率提高。

CPG Frits合成片段產量（引物合成）

length↓/Frit scale→	50 nmol	100 nmol	200 nmol	500 nmol
24mer	3-6OD	7-12OD	15-25OD	36-60OD
36mer	4-7OD	8-15OD	17-30OD	40-65OD
48mer	5-9OD	9-20OD	20-35OD	N/A
60mer	6-10OD	10-20OD	25-40OD	N/A
90mer	6-14OD	12-30OD	N/A	N/A

CPG Frits合成片段產量（基因合成)

length↓/Frit scale→	5 nmol	10 nmol	25 nmol	50 nmol
60mer	1-3OD	2-5OD	5-12OD	8-25OD
90mer	1-3OD	2-6OD	6-14OD	10-26OD
120mer	1-4OD	9-20OD	20-35OD	12-28OD
150mer	6-10OD	10-20OD	25-40OD	14-30OD