酶標抗體製備技術

酶標抗體製備技術基本要求是將酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合既不改變抗體的免疫反應活性，也不影響酶的生物化學活性。用於標記抗體的酶較多，常用的有辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。

基本介紹

• 中文名：酶標抗體製備技術
• 外文名：horseradish peroxidase
• 縮寫：HRP
• 技術基本要求：酶分子與抗體共價結合

辣根過氧化物酶標抗體製備技術

辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）廣泛分布於植物中，因辣根中含量最高而得名，由無色酶蛋白和深棕色鐵卟啉（輔基）構成一種糖蛋白（含糖18%）。此酶溶於水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。

HRP分子量較小（40kDa），標記物容易穿透入細胞內部；作用底物為H2O2，以二氨基聯苯胺（DAB）為供氫體的反應產物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察；在pH3.5～12範圍內穩定，對熱及有機溶劑的作用亦較穩定，能耐受63℃加熱15min；用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性；溶解性好，100mL緩衝鹽溶液中可溶解5gHRP，並可溶解於62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級沉澱法分離純化；氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對HRP的活性有抑制作用，應避免使用NaN3作為酶標試劑的防腐劑，以防止失活。

凡能在HRP和H2O2存在時被酶催化H2O2反應而和成有色產物的化合物（供氫體）都可以用顯色劑。供氫體的產物分不溶性和可溶性兩類。前者最常用的為3，3‘二氨基聯苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，適用於免疫組化法；反應後的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產物，適用電鏡檢查；此外還有飽和聯苯胺溶液，氧化後產物呈黃褐色，多用於酶免疫擴散的深沉線顯色。後者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，產物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm，可用肉眼判別；易被濃酸終止反應，顏色可數小時不變，是ELISA中最常用的一種；但對光敏感，使用時要避光，並發現有致癌作用。

用HRP標記抗體需藉助交聯劑的作用，將酶連線在抗體分子上。常用的交聯劑為過碘酸鈉和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。

改良過碘酸鈉法

HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff鹼。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應發生自身偶聯，在標記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結合反應後，再加入硼氫化鈉(NaHB4）還原成穩定的結合物。

[標記步驟]

（1）取5mg HRP溶於0.5mL蒸餾水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）無水乙醇溶液0.1mL，室溫（20℃±）下輕微攪拌作用1h。

（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色。

（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室溫（20℃±）下輕攪作用1 h，終止氧化反應。

（4）加入5mg抗體（Ig），裝入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩衝液（無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g,蒸餾水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析過夜，更換3次。

（5）取出透析袋中液體（約3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或過夜。

（6）加50%飽和硫酸銨（NH4）2SO4溶液（硫酸銨850g，蒸餾水加至1 000 mL，以30%氨水調pH7.2）6 mL沉澱結合物，置4℃30min後，3 000r/min離心30min，取深沉（SPA不需要進行此步）。

（7）將沉澱物溶於PBS（0.02M pH7.4）中，裝入透析袋，並以此緩衝液透析平衡6-12h，換液3次。

（8）在結合物內加入BSA至蛋白濃度為10mg/ mL，或加等量60%甘油，測定工作效價後，小量分裝（或凍乾，不需加甘油），低溫保存備用。

戊二醛交聯法

戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯劑，通過它的兩個醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結合物。反應可在4-40℃溫度範圍，pH6.0～8.0 的緩衝溶液中進行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標記抗體混合，同時加入戊二醛進行交聯反應。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結合物，結過透析或層析除去未結合的戊二醛，然後再與抗體結合。

[標記步驟]

（1）取10mgHRP溶於0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB將25%戊二醛稀釋為1.25%)，室溫（20℃左右）反應結合18h。

（2）用0.15mol/LNaCl平衡過的Sephadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析過夜。

（3）將5mg抗體IgG溶於1mL0.15mol/L NaCl，再與醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。

（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸鹽緩衝液（調節pH至9.0～9.6），4℃，電磁攪拌下結合24h。

（5）加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸（0.29g溶於10mL蒸餾水），4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應。

（6）裝入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析過夜，或通過Sephadex G-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液，加入等量60%甘油，測工作效價後，小量分裝，4℃或-20℃保存。

過氧化物酶

簡介

抗過氧化物複合物製備技術

Stemberger(1970)等，首先報導了過氧化物酶-抗過氧化物酶複合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也稱為非標記抗體酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化學交聯劑處理酶和抗體，二者活性不受化學反應的影響，可大大提高免疫酶法的靈敏度。

標記步驟

（1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃離心20min，取上清液。

（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混勻，室溫（20℃±）靜置1h，16 000r/min，4℃離心20min，取沉澱物。

（3）加冷生理鹽水反覆洗滌-離心（16 000r/min，4℃離心20min）3次，棄上清，取沉澱物。

（4）加入過量HRP溶液4mL（2mg/mL）混勻後，移至小燒杯內。

（5）在pH計監控下，邊攪拌邊加入0.1及0.01mol/L HCl調至pH2.4左右，使沉澱完全溶解。

（6）立即加入0.01mol/LnaOH,調pH7.4，16 000r/min，4℃離心20min，取上清液。

（7）加入1/10體積的0.075mol/L醋酸鈉和0.15mol/L醋酸銨的等量混合液後混勻。

（8）電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，並繼續攪拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃離心20min，去上清，取深沉物。

（9）以50%飽和硫酸銨洗滌，4℃、16 000r/min×20min，離心2次，取深沉物。

（10）加5mL蒸餾水將深沉物溶解後裝入透析袋，用Ph6.75醋酸鹽緩衝液（13.5L生理鹽水、1.5L蒸餾水、75mL 1.5mol/L醋酸鈉及75mL粉酶3moL/L醋酸銨）4℃透析3d，每天換液2次。

（11）17 000r/min，4℃離心20min，取上清液進行工作效價鑑定。

（12）加等量60%甘油，小量分裝，-20℃保存。

McAb-PAP製備技術

用抗HRP McAb製備PAP複合物的工藝條件較為簡便，而且不需嚴格的條件限制。用小鼠抗HRP McAb製備的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反應2h，即成鼠PAP複合物。以按HRP/IgG克分子比為4︰1製備為宜。

鹼性磷酸酶標抗體製備技術

簡介

鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛腸黏膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，由多個同功酶組成。從小牛腸黏膜提取的AP分子量為100kDa，酶作用的最適pH為9.6；從大腸桿菌中提取酶分子量為80kDa，最適pH為8.0。它的作用底物較多，常用的酶底物有對硝基本磷酸鹽（PNP）、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。AP主要用作雙標記染色，研究遞質共存及酶免疫測定。AP標記抗體，一般採用戊二醛作交聯劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個醛基結合。

標記步驟

（1）取抗體（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。

（2）裝入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，換液3次。

（3）加入2.5%戊二醛20uL，室溫（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析過夜，換液3次。

（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl緩衝液中，4℃透析過夜，換液3次。

（5）取出標記抗體，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl緩衝液稀釋至4mL，即為酶標記物原液。

（6）加入1/3量純甘油，測定工作效價後，小量（0.1mL）分裝，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐溫溶液將結合物適當稀釋）。

鹼性磷酸酶

-抗鹼性磷酸酶複合物製備技術

Mason等（1978），用鹼性磷酸酶代替過氧化物酶，建立了鹼性磷酸酶-抗鹼性磷酸酶複合物（APAAP）橋聯酶標技術。但以AP作為抗原用常規免疫方法製備的抗血清，很難達到APAPP橋聯酶標技術的質量要求，在一定程度上限制了此項技術的推廣使用。楊志剛等（1989）利用抗AP的McAb建立了一種製備APAAP複合物的簡便方法。只需將AP和抗AP的McAb以適當比例混合，4℃結合過夜即可使用。採用改良的ELISA方法檢測APAAP複合中AP的最適含量。具體方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分別加入不同量的AP作用後經過洗滌；加底物顯色，測定光密度值（OD）。在一定範圍內，APAAP複合物溶液中AP含量增加的同時，相應的OD值也隨之增大；當AP增加到一定量時（約6～8mg/mL）、OD值保持穩定。