連線酶鏈式反應

連線酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)，是在連線酶擴增反應或連線酶檢測反應的基礎上，引入熱穩定的連線酶而建立的類似PCR 技術的新方法。LCR 既可擴增，又可鑑定D N A 異常，與PCR 技術一樣可用於已知病因的遺傳病大面積普查。

基本介紹

• 中文名：連線酶鏈反應
• 外文名：Ligase chain reaction
• 發明者：Backman
• 發明時間：1997

基本原理

LCR ，即在D N A 連線酶的作用下，通過連線與模板D N A互補的兩個相鄰寡核苷酸鏈，快速進行D N A 片段擴增。D N A連線酶可將與模板D N A 鏈互補的兩條毗鄰寡核苷酸片段連線起來，兩條寡核苷酸連結頭處存在鹼基錯配則阻止連線反應的發生。所以通過連線酶反應，可明確區分寡聚核苷酸是否與模板D N A 完全互補，檢測基因點突變。耐熱D N A 連線酶在不同溫度組成的循環中活性保持不變。這樣，在適當的緩衝體系中加入模板D N A 。一套寡聚核苷酸片段，耐熱D N A 連線酶，將上述反應體系加熱，使模板D N A 在高溫下（94 ℃）一分鐘變性，解鏈；然後將反應體系降至退火溫度（65 ℃），4 分鐘使模板寡聚核苷酸互補成雙鏈；D N A 連線酶催化兩相鄰的寡核苷酸連線起來。如此循環改變溫度，連線反應重複進行，使目的D N A 得到擴增。如果兩寡核苷酸接頭處存在錯配鹼基，則沒有擴增產物的產生，擴增產物可通過聚丙烯醯胺電泳加以鑑定。

發展過程

連線酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)，是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點突變而設計發明，並申報了專利.1988年Landegren也進行了該項研究。1988年Backman等又因分離熱穩定的連線酶，而申報專利，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連線酶進行了LCR試驗。耐熱DNA連線酶可以在熱循環中保持活性，提高連線反應的特異性，排除了背景擴增和免除了不斷補充酶的繁瑣程式。合成一對引物A、B，它們完成覆蓋了靶序列。經退火與靶序列結合後，A、B間留下一個缺口(nick)，加入連線酶封閉缺口，兩引物成靶序列完整的互補鏈。如果靶序列中有點突變，引物不能與靶序列精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連線反應不能進行，變性後引物仍是兩個。Lan-degren用生物素標記引物A，用32P標記引物B。用親和素包被的瓊脂糖珠與連線產物反應，檢測其放射性。顯然，當靶序列中存在點突變時，檢測結果是陰性的。用這種方式，Landegren將人β-珠蛋白βA、βC、βS三個等位基因區別開來。Wu等人又引入PCR的原理，在連線反應後，變性、退火、再連線，少量的靶序列就被擴增出來。Barany於1991年報導了耐熱連線酶-Taq連線酶的發現及其在LCR中的套用，為LCR的實用化奠定了基礎。實際操作時引物為4個，A、 A’和B、B’，分別與靶序列的正負鏈互補。每次連線反應的產物又可在下一輪反應中當模板，靶序列以指數形式擴增出來。用上面提到的標記檢測方法，即可檢測靶序列中有無點突變。

LCR的特異性首先取決於引物與模板的特異結合，其次Taq連線酶作用的特異性，即Taq連線酶是否僅連線與靶序列完全互補的引物。實驗表明Taq連線酶的非特異活性是較低的(<1%)。控制模板、酶的濃度，使反應在接近Taq酶的溫度下進行，還可進一步降低非特異連線率。Barany用這一技術，將極少量(<200個分子)的βA、βC和βS區別開來。

LCR的擴增效率與PCR相當。由於有很高的信噪比，其敏感性也很高。用Taq連線酶做LCR只在兩個保溫點的循環(94℃、1min和65℃、4min)。產物檢測也非常方便、敏感。因此可以說LCR是目前檢測已知序列中有無點突變的最佳方法。