缺口平移

介紹

nick translation法,標記DNA探針.

缺口翻譯法或切口平移法是實驗室最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。利用E.coli DNA多聚酶I的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中從而形成高比活性的均勻標記的DNA探針。線狀、超螺旋及帶缺口的環狀雙鏈DNA均可作為缺口平移法的模板。

基本原理

以限量的DNase I在待標記的雙鏈DNA的每一條鏈上產生若干個單鏈缺口；再利用E.coli DNA多聚酶Ⅰ的 5’-3’外切酶活性和5’-3’多聚酶活性，在缺口處的5’末端每切除一個核苷酸，則在3’末端添加一個核苷酸，以修補缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動，標記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。

此法特點是快速、簡便、標記的探針均勻、特異性高；適用於較長的雙鏈DNA；DNA多聚酶必須是E.Coli DNA多聚酶的全酶；DNA酶Ⅰ的濃度一定要適宜。

基本操作步驟

1、用DNase I處理雙鏈DNA，使之隨機產生單鏈斷裂。

2、DNA聚合酶I的5‘-3’外切酶活性從斷裂處5‘除去一個核苷酸，同時5‘-3聚合酶活性將一個放射性核素標記的單核苷酸引入到斷裂的3'端。

3、反應重複進行，結果標記的核苷酸代替了原來的核苷酸殘基，形成了放射性的DNA分子。