基本介紹
- 中文名：細胞核重編程
- 對象：細胞內的基因表達
- 目的：避免異體移植產生的免疫排斥反應
- 方向：移植
簡介,背景理論知識,相關的機理,核的移植,效率問題,細胞核重編程的機制,細胞融合提取物,誘導多能性,品系轉變,蛋白質,展望未來,
簡介
通過這一技術，可以在同一個體上將較容易獲得的細胞（如皮膚細胞）類型轉變成另一種較難獲得的細胞類型（如腦細胞）。這一技術的實現將能避免異體移植產生的免疫排斥反應。
背景理論知識
在受精卵發育成一個成熟個體的過程中，特定類型的細胞一般都是沿“單行道”形成。隨著發育的不斷進行，這些細胞就會逐漸失去可塑性，成為不可逆的某一特定類型細胞。例如，一個皮膚細胞不會自動地轉變成為一個腦細胞，而小腸細胞也不會轉變成心臟細胞。然而，卻有一些實驗方法可以使不同類型細胞之間的轉換成為可能。這些方法都是利用細胞核重編程的原理，也就是說讓一種類型細胞的核基因表達轉變成為胚胎細胞或者其它類型細胞的狀況。這一機制引起了科學界的廣泛興趣。
衰老的“生物分子自然交聯學說”指出：生物生長、發育、衰老的根本原因是細胞的增殖和分化，是各種生物大分子中化學活潑基團相互作用導致的進行性分子交聯。該學說在論證生物體衰老的分子機制時指出：生物體是一個不穩定的化學體系，屬於耗散結構。體系中各種生物分子具有大量的活潑基團，它們必然相互作用發生化學反應使生物分子緩慢交聯以趨向化學活性的穩定。而隨著時間的推移，交聯程度不斷增加，生物分子的活潑基團不斷消耗減少，原有的分子結構逐漸改變，這些變化的積累會使生物組織逐漸出現衰老現象。
一個衰老的細胞，其分裂和增殖已經停止，其中的DNA及其他生物分子大部分均處於交聯結合狀態、生物分子的交聯反應向活性分子不斷減少的更衰老方向趨衡；但是，如果衰老細胞能夠重新步入分裂增殖的軌道或者用其他方式使其生成活性生物分子的速度明顯大於交聯失活速度，則可以打破這種活性分子不斷減少的更衰老趨衡而使細胞回復到比較年輕甚至全能的狀態。
相關的機理
核的移植
將一個活細胞核成功地移植到已經去核的蛙卵中的實驗，首次證明可以通過實驗方法來逆轉細胞的分化狀態。Briggs和King首次成功實現通過移植Rana pipiens的囊胚細胞核產生會遊動的蝌蚪。但是，他們發現如果移植的是處於胚胎髮育較晚階段（腸胚）的細胞核，就會出現非正常發育現象。於是，他們提出細胞分化可能涉及不可逆轉的細胞核轉變。不久之後，有人在南非青蛙Xenopus laevis上進行了相似的實驗。按照同樣的實驗方法，他們發現即使用於移植的核是來自於完全分化的細胞，也能得到發育完全正常並且具有生育能力的雄性和雌性青蛙，在該實驗中是供體蛙的小腸上皮細胞。這些實驗結果告訴人們，細胞分化是可以被完全逆轉的，並且不可逆的細胞核變化是非必須的。這一過程涉及細胞核基因表達的改變，但並不涉及基因本身。因此，即使在發育過程中，細胞之間也能變成彼此不同、具有各自功能且能穩定存在的個體，但是基因組在所有不同細胞類型中都是一樣的（產生抗體的免疫細胞除外）。因此，它們具有保持形成其它不同類型細胞的潛力。
這一領域的突破來自於多利羊的實驗，這個實驗將從成體羊身上分離出來的，並且在體外培養的乳腺細胞的細胞核移植到去除了細胞核的羊卵內，從而產生出正常成體山羊。多利羊以及後來的探索研究表明，可以利用成體哺乳動物的細胞核來完全逆轉細胞分化過程，並且暗示，這一個機制可能也適用於人類。通過移植成體猴細胞核得到猴胚胎幹細胞的實驗就是證明這一假設的重要一步。這些具有完善的生長和分化功能的細胞是從用成體猴的細胞核移植到去核猴卵細胞後發育成的胚泡中分離出來的。因此，在人類的卵子裡面也非常可能包含著能逆轉成體人類細胞分化進程的因子。
效率問題
實現卵細胞誘導的完全重編程的公認標準是產生一個包含任何一種細胞類型（被定義為全能性）並且具有生育能力的成體個體。 但是，從醫學治療的角度看，我們認為得到的細胞是否具有全能性，甚至多能性（即具有分化成大多數細胞類型的能力）（圖1A）並不是一個必須具備的屬性。例如，在治療上，一個脊椎損傷的病人，就沒有必要為其提供能夠分化成任何一種細胞類型的細胞。在討論體細胞核移植的時候，知道利用來源於完全不相干的另一種細胞的細胞核來進行移植，並且得到特定類型細胞的效率是很重要的。已有實驗結果顯示，細胞核重編程的效率會隨著供體細胞的分化程度加深而降低（圖2）。通過一系列的核轉移實驗（從一個核移植胚胎中將細胞核移植到另一系列的去核卵子中）以及核嫁接實驗（從一個核移植胚胎中將細胞核移植到從同一品系受精卵發育而來的受體胚胎中），得出了約30%的小腸上皮細胞核能夠產生具有功能的肌肉和神經細胞這一結論。在哺乳動物身上，可以從核移植胚泡的細胞中產生胚胎幹細胞，並且可將這些細胞移植到正常的受體胚胎中去測試它們的分化能力。相對於用胚胎細胞核所能達到的30%的效率，用已分化細胞的細胞核得到正常動物的效率通常在1%到2%之間。到目前為止，還沒有從相距甚遠的異物種組合，包括將人的細胞核移植到猴卵母細胞的細胞質中，從而得到可以傳代的胚胎幹細胞的證據。
細胞核重編程的機制
用卵子進行細胞核重編程值得關注的一個地方是卵子具有以100%的效率重編程已經定向分化了的精子細胞核的能力。另外一個優點是利用這一方法並不需要對移植的細胞核及其產生的重編程細胞進行永久的遺傳學改變（即病毒插入、強制打開特定基因等）。因此，挖掘出其中的機理就顯得格外重要。我們需要解決的問題是為什麼重編程能夠成功實現？而又是什麼因素常常導致這一過程的失敗，即便是在使用卵子細胞的情況下？
有人利用卵母細胞（第一次減數分裂早期的雌性生殖細胞，是產生卵子的前體細胞）探索了卵細胞（處於第二次減數分裂中期）的重編程機制。許多移植進卵母細胞生殖泡的哺乳動物體細胞核被直接重編程而表達幹細胞標誌基因，包括Oct4, Nanog和Sox2（圖1B）。在卵母細胞內進行的細胞核重編程不會產生新的細胞，但是與卵子相反的是，這一過程的發生既不需要細胞分裂，也不需要蛋白質的合成。與這個重編程伴隨而生的機制包括：異染色體的開放（圖3）；分化標記，如DNA甲基化的去除；組蛋白修飾以及組蛋白交換等等。這些機制發生的基礎是，受精卵擁有能引起上述效應的高濃度特定蛋白。如果卵子的蛋白能夠在幾秒或幾分鐘的時間內被交換到移植進來的體細胞核的話，那么完全重編程就應該總會發生。
但是，這個概念卻和另一個事實相悖，那就是卵子常常不能完全重編程植入其中的體細胞核。如果以上所說的染色體蛋白迅速交換適用於卵子裡用來重編程受精卵的細胞核的話，在卵細胞第一次分裂之後，蛙類細胞就會需要一定的時間，並且哺乳動物細胞需要更多的時間去完成徹底的重編程。但這通常不會發生。一個可能的原因是移植進來的細胞核攜帶了供體細胞的表觀遺傳學記憶。例如，在肌肉細胞里取出的細胞核，用於重編程後，在重編程的胚胎里發育出來的神經或其它非肌肉細胞里還會強烈的表達與肌肉相關的基因。這可能是由卵子組蛋白里大量存在的H3.3亞型整合到核移植後的供體細胞核里所引起的。組蛋白H3.3的表達被認為能阻礙重編程的發生，並且會保留以前基因表達的記憶。
細胞融合提取物
從技術發展的角度來看，是有可能讓兩個細胞發生融合，同時用細胞分裂抑制劑來保證融合後兩個細胞核是分離的（圖1C）。在這些融合體裡面，主導細胞通常是體積較大並且分裂活性較強的那個，而且還會影響另外一個細胞核的基因表達情況。這方面的例子包括紅細胞和體外培養的正在增殖的細胞的融合，以及人類肝臟細胞和肌肉多核細胞的融合。如果去掉細胞核的一種體細胞的細胞質與另外一種細胞融合的話，它們也會將供體細胞的表達譜強加於受體細胞的細胞核之上。但是，由於這些融合細胞生長不佳，因而也沒有太大的醫學意義。
我們可以從上述這些實驗中得到一些重要的結論。其一，細胞核的漲大和染色體的去染色質化會發生在基因表達譜的重編程之前（圖3）。其次，新的基因表達譜並不依賴於供體基因表達譜的退去或者細胞分裂。所以上述這些都不是重編程所必需的。再一個重要的結論就是，分化的細胞以及胚胎的細胞包含可以改變其它細胞的細胞核基因表達情況的調節分子。當受體細胞體積非常大的時候，例如卵子或肌肉束（100個或更多的肌肉細胞形成的大型細胞），它自身的調節分子大大超過可以讓細胞產生出現胚胎幹細胞特徵的外來調節因子就變得可以理解了（圖4）。這些分子在正常生理情況下的作用可能是確保這些細胞以及它們的後代不會逃離它們所屬的種系或者改變細胞類型。換句話說，細胞似乎在不停地重編程自我以保證它們自己以及後代保留在原來的品系裡面。
誘導多能性
該領域一個驚人突破發生在2006年，Takahashi和Yamanaka發現向小鼠成體成纖維細胞里轉入四個基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）以後，這些細胞能被誘導成為具有胚胎幹細胞特徵的細胞。後來引入Nanog表達的篩選系統後，得到的幹細胞移植到具有免疫耐受能力的受體胚胎時，還顯示出參與發育的能力。因此可以證明它們是具有多能性的，所以叫做誘導性多能幹細胞，或稱iPS細胞。從人的體細胞上獲得多能幹細胞也需要上述的四個轉錄因子或者另外一組由Oct4、Sox2、Nanog和Lin28組成的重編程基因。這些程式現在已經得到確認並得到了發展。實驗已證實iPS細胞可以從終末分化的胃和胰臟細胞中得到，並且在去除癌基因c-Myc的情況下也能得到。這些幹細胞似乎與胚胎幹細胞並沒有多大的區別，並將有可能最終培養出病人特異性細胞來進行細胞治療，也可用於提供合適的能分化為各種組織的細胞來源，或者用來測試潛在的治療藥物。但是，這些都需要在採用改良方法去除由病毒載體引起的基因組插入隱患後才有可能成為現實。最近的成果表明，穩定的基因組插入並非必不可少，並且有研究報導稱可以使用腺病毒或者質粒來傳導外源基因，意味著我們離成功又進了一步。
通過導入外源因子而使分化的體細胞變成iPS細胞的機理目前還不清楚。因為在早期的實驗中，這些細胞出現的比例是如此之低（起始細胞的1\10000~1\1000），並且被感染的細胞一般需要在外源因子存在的情況下增殖將近兩個星期，這些看似是偶然形成的iPS細胞的來源確實難以分析。在某些情況下，多能性狀態的維持可能需要抑制分化程式，其可能涉及的機制已經在其它綜述里提及。
品系轉變
通過外源表達基因來改變細胞的分化類型在很多年前就由Weintraub發現“主導基因”MyoD後提出了。過表達這個在肌肉細胞里特異表達的轉錄因子就足以將一系列非肌肉細胞轉變成為肌肉細胞了。然而，在其它一些類型的非肌肉細胞里，這種轉變只是暫時的，或者根本就無法觀察到。在觀察到肌肉樣的細胞出現之前，在好幾個細胞世代里對外源MyoD表達的選擇是必需的。一旦轉變成為肌肉細胞以後，MyoD就會激活自身的持續表達，外源MyoD的過表達就不再是必需的了。
細胞類型的轉換在其它好幾種細胞類型之間，特別是形成血液的細胞品系之間，也可以通過外源表達一些轉錄因子來實現。這些轉錄因子的相互平衡能激活或抑制決定細胞命運的基因表達。在這些變化當中（圖5C），在新類型細胞形成之前，可能涉及一個倒退到分化程度較低的狀態，也就是一個去分化過程。就MyoD而言，培養的細胞經過許多細胞分裂的選擇才能最終形成新的細胞類型。
在這個領域的一個最新的進展就是將胰腺的外分泌細胞直接轉變成內分泌的β細胞（圖5D）。在這個研究當中，用腺病毒轉入三個通常為胰島β細胞分化所需的轉錄因子：Pdx1、Ngn3和MafA後，就能夠將20%的成功轉染的外分泌細胞轉變成能產生胰島素的β細胞。攜帶外源基因的腺病毒不必整合到外分泌細胞的基因組當中，並且對外源基因表達的需求也是暫時的。另外，這一品系轉變並不需要細胞分裂。這個細胞品系轉換和由Yamanaka最早做出的iPS一樣，為轉變細胞命運提供一條共同的策略，那就是設法找出一系列的轉錄因子來實現細胞類型之間的轉變。
蛋白質
細胞分化的兩個基本特徵影響著我們對細胞核重編程的理解。一個是每種細胞似乎都表達著一些決定它們分化狀態的基因，這一特徵在細胞融合實驗中尤其明顯。因此，肌肉細胞就會通過自激活高水平的例如MyoD這樣的基因去維持自身的狀態。這樣，細胞越大，或者越像胚胎幹細胞，它就會擁有更多“自我重編程”分子。因此，卵子在沒有添加外源因子的情況下也很容易被重編程。
在所有重編程的實驗裡，第二個基本特徵是當細胞的分化程度變得越高，通過外源基因來重塑表達譜就變得越困難。當細胞開始它們的終末分化道路時，分化的細胞狀態變得越來越牢固，並且堵上其它不恰當的分化途徑。掌握這個理論成為這一研究領域的一個巨大挑戰，並且大量的信息化工作已經在DNA和組蛋白層面上展開了。一個普遍的假說就是“快速逃逸”策略。我們提出在非活性轉錄基因的調控區，DNA和組蛋白的結合會變得越來越緊密。雖然大多數的蛋白質會以幾秒鐘或幾分鐘一次的頻率解離與之結合的DNA，並且在一些特殊情況還需要更長的時間，一個由多組分組成的蛋白複合物則可能會在DNA上擁有很長的逗留時間。因此，一個蛋白複合物的所有組分都剛好解離DNA，並且讓重編程因子結合上去的幾率非常小。在胚胎幹細胞里，大多數基因（在分化的細胞里這些基因是具有活性的基因）就會處於一種去濃縮的狀態，使大蛋白複合物具有較短的逗留時間。
根據這個假說，無論是通過核移植、細胞融合、iPS，還是轉分化來實現的重編程的發生幾率都依賴於統計學上DNA調控區域的可進入程度、作用時間、轉錄本的濃度和其它調控因子。體積大並且擁有大量調節因子的細胞，如卵子和肌肉管，就會像其它通過實驗增強轉錄因子濃度的細胞一樣容易被重編程。未來，一個重要的突破就是要掌握為何分化後細胞的細胞核比胚胎細胞的細胞核更難以重編程。這可能涉及到了組蛋白去濃縮化的解釋。
展望未來
核移植、iPS技術以及轉分化之間的機理會不會是一樣的呢？或許不會。快速逃逸的概念可能都適用於上述幾種情況，不過實際上起重編程作用的因子是不盡相同的。我們已經知道卵細胞具有某些濃度非常高的分子，如核漿、組蛋白B4以及組蛋白H3.3等。而最終識別出卵細胞重編程因子，將有助於改善iPS的效率和找到更多成體細胞之間品系轉換的途徑。
一個人擁有10^15次方個細胞，而一個肝臟就包含10^14次方個細胞。為了達到這個數目，一個以10^4的效率從皮膚產生出來的iPS細胞需要經過大量的細胞分裂周期才可達到。儘管如此，人體的某些組織只需要相當少量的細胞就能改善功能了。一個例子就是視網膜，僅105的細胞就具有治療效應。
要是導入的細胞沒有“整合”到受體裡面的話，這些細胞還會有利用價值嗎？大部分的組織是由許多不同類型的細胞組成的。以胰臟為例，包含了外分泌細胞、管道細胞以及胰島細胞在內的至少四種能分泌激素的內分泌細胞。內分泌細胞的替代治療具有巨大的治療價值，即使它們並沒有整合到胰臟複雜的結構當中。在某些情況下，導入的細胞即使是以間接的形式也能提供功能上的便利。到目前為止還不清楚導入的細胞是否能提供適量的產物。
展望未來，更多的細胞替代治療途徑或許會出現。其中一個可能就是找到能夠進入細胞內的小分子來取代外源基因導入細胞內，又或許能在成體器官內找到越來越多的自然分裂的細胞群體，並且這些細胞能在體外被培養與擴增，然後用於移植。未來的研究方向，至少在我們看來，應該鎖定在“單一多能性”或者“寡多能性”（只能產生一種或幾種細胞類型）的研究上，即使不是多能性（能分化成三胚層的細胞的能力），也絕不應該是全能性（能分化成所有胚胎和胚胎外細胞類型的能力）（圖5）。以此類推，我們更願意做到通過轉換與所需細胞類型相近的一種正常細胞來產生所需的細胞類型，而不是將細胞先轉變成全能性的狀態再慢慢的從一個很大的範圍來縮小它們的分化道路。如果僅是為了達到細胞替換治療的目的，全能性或者生殖系傳遞能力都不是必需的標準或者目標。如果僅從治療的角度看，一個具有一定分化能力，但是這種分化能力並非無限制的狀態可能更為安全和有效。
