捕捉外顯子的載體pETV—SD是一種反轉錄病毒穿梭載體(shuttle vector)，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細菌和哺乳動物細胞等進行複製的載體。
基本介紹
- 中文名：外顯子捕捉
- 外文名：exon trapping
- 類型：動物細胞複製載體
外顯子捕捉
【exon trapping】
是構建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。
外顯子捕捉(exon trapping) 是構建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕捉外顯子的載體pETV—SD是一種反轉錄病毒穿梭載體(shuttle vector)，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，因為凡是有內含子和外顯子的基因在轉錄後都要經過RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicing donor，SD)位點和剪接受體(細菌和哺乳動物細胞等進行複製的載體(見右圖)。splicing acceptor，SA)位點。因此，SA位點可作為基因的標誌。pETV—咀載體的克隆位點上游有一個“外顯子捕捉序列”(exon trap cassette)，可用來識別載體的插入片段中有無SA位點。它含有β—珠蛋白(HBG)基因的第1個外顯子及其有功能的SD位點，該基因的間隔序列(IVS)和α，β—半乳糖苷酶(αβ—GAL)基因。操作步驟及其基本原理是：
(1)基因組DNA經“霰彈法”切成小片段後，克隆在位於“外顯子捕捉序列”下游的克隆位點上。
(2)將這些重組載體匯總後感染反轉錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質產物使載體(自身不能合成病毒蛋白質)成為反轉錄病毒在細胞里增殖。當反轉錄病毒在細胞內轉錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發生RNA剪接反應而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養液中收集後用來感染兼宿反轉錄病毒包裝細胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉錄病毒再進行一輪複製，並產生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由於上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪複製時則大大提高了RNA剪接的機會。
(4)從第二個細胞系PA-317細胞中分離得到的病毒，用來感染組成型產生SV40T(腫瘤)抗原的COS細胞。病毒RNA基因組被反轉錄，並在載體上的SV40複製起點作用下，以環狀DNA附加體形式進行複製。
(5)從COS細胞中回收複製的附加體DNA，經限制性內切酶Dpn I 酶切後轉化細菌。在含卡那黴素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養基上挑選轉化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產物。因此，不產生β—半乳糖苷酶的轉化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由於基因發生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由於在反轉錄病毒生活周期的RNA時期中發生了剪接反應，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突變，則大多數將是缺失了載體中的“外顯子捕捉”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段為探針作菌落雜交，很快可得到驗證。
(8)如果是真正發生了RNA剪接事件，準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕捉陷阱的插入片段中的外顯子序列連線，這可直接測定其序列加以證明。
從捕捉到的外顯子出發，就可進一步用作探針去從基因組基因文庫或cDNA文庫中分離出基因。
