化學品毒性鑑定技術規範

中華人民共和國衛生部關於印發《化學品毒性鑑定技術規範》的通知，該規範自2005年10月1日起施行。

基本介紹

• 中文名：化學品毒性鑑定技術規範
• 時間：2005年10月1日
• 頒發部門：中華人民共和國衛生部
• 編號：衛監督發〔2005〕272號

簡介

中華人民共和國衛生部關於印發《化學品毒性鑑定技術規範》的通知

衛監督發〔2005〕272號

各省、自治區、直轄市衛生廳局，新疆生產建設兵團衛生局，中國疾病預防控制中心、衛生部衛生監督中心：為了規範化學品毒性鑑定工作，加強對化學品毒性鑑定工作的管理，根據《中華人民共和國職業病防治法》和《危險化學品管理條例》等法律法規的規定，我部組織制訂了《化學品毒性鑑定技術規範》。現印發給你們，請遵照執行。本規範自2005年10月1日起施行。實施中出現的問題，請及時反饋我部衛生執法監督司。

附屬檔案：化學品毒性鑑定技術規範

二○○五年七月十一日

化學品毒性鑑定技術規範

總則

General Principles

依據

根據《中華人民共和國職業病防治法》、《作業場所使用有毒物品勞動保護條例》、《危險化學品安全管理條例》、《職業衛生技術服務機構管理辦法》、《化學品毒性鑑定管理規範》制定本規範。

範圍

本規範規定了化學品毒性鑑定的毒理學檢測程式、項目和方法，適用於化學品毒性鑑定和評價。

規範性引用檔案

GB 14924-2001 實驗動物與飼料標準

GB 14925-2001 實驗動物 環境及設施

OECD Guideline for Testing of Chemicals (1981 ~ 2002)

USA Code of Federal Regulations, Title 40, Volume 28

USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (1996 ~ 2000)

術語解釋

化學品（Chemicals）：本規範所稱化學品，系指工業用和民用的化學原料、中間體、產品等單分子化合物、聚合物以及不同化學物組成的混合劑與產品。不包括法律、法規已有規定的食品、食品添加劑、化妝品、藥品等。

急性吸入毒性（Acute InhalationToxicity）：實驗動物短時間（24h內）持續吸入一種可吸入性受試樣品後，在短期內出現的健康損害效應。

半數致死濃度（Median Lethal Concentration，LC50）：指在一定時間內經呼吸道吸入受試樣品後引起受試動物發生死亡機率為50%的濃度。以單位體積空氣中受試樣品的質量(mg/m)來表示。

急性經皮毒性（Acute Dermal Toxicity）：實驗動物短時間（24h內）經皮膚接觸受試樣品後，在短期內出現的健康損害效應。

急性經口毒性（Acute Oral Toxicity）：一次或在24h內多次經口給予實驗動物受試樣品後，動物在短期內出現的健康損害效應。

半數致死劑量（Median Lethal Dose，LD50）：在一定時間內經口或經皮給予受試樣品後，使受試動物發生死亡機率為50%的劑量。以單位體重接受受試樣品的質量(mg/kg bw或g/kg bw)來表示。

皮膚刺激性（Dermal Irritation）：皮膚塗敷受試樣品後局部產生的可逆性炎性變化。

皮膚腐蝕性（Dermal Corrosion）：皮膚塗敷受試樣品後局部引起的不可逆組織損傷。

眼刺激性（Eye Irritation）：眼球表面接觸受試樣品後產生的可逆性炎性變化。

眼腐蝕性（Eye Corrosion）：眼球表面接觸受試樣品後引起的不可逆性組織損傷。

皮膚致敏（過敏性接觸性皮炎）(Skin Sensitization，Allergic Contact Dermatitis)：皮膚對一種物質產生的免疫源性皮膚反應。對於人類這種反應可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特徵。動物的反應不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。

亞急性經口毒性（Subacute Oral Toxicity）：實驗動物在14～28天內，每日經口接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

亞急性經皮毒性（Subacute Dermal Toxicity）：實驗動物在14～28天內，每日經皮接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

亞急性吸入毒性（Subacute Inhalation Toxicity）：實驗動物在14～28天內，每日經呼吸道接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

致突變性（Mutagenicity）：受試樣品引起原核或真核細胞、或實驗動物遺傳物質發生結構和/或數量改變的效應。

免疫毒性（Immunotoxicity）：受試樣品引起機體免疫功能抑制或異常增強的效應。

神經毒性（Neurotoxicity）：受試樣品對神經系統功能或結構的損害效應。

亞慢性經口毒性（Subchronic Oral Toxicity）：實驗動物在其部分生存期（不超過10%壽命期）內，每日經口接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

亞慢性經皮毒性（Subchronic Dermal Toxicity）：實驗動物在其部分生存期（不超過10%壽命期）內，每日經皮接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

亞慢性吸入毒性（Subchronic Inhalation Toxicity）：實驗動物在其部分生存期（不超過10%壽命期）內，每日經呼吸道接觸受試樣品後所引起的健康損害效應。

蓄積毒性（Cumulative Toxicity）：受試樣品在體內蓄積引起的有害效應，蓄積有兩種形式：（1）物質蓄積，即長期反覆接觸受試樣品時，由於吸收速度超過消除速度導致的該物質在體內逐漸增多；（2）功能蓄積，即受試樣品雖然在體內的代謝和排出速度較快，但其造成的損傷恢復慢，在前一次的損傷未恢復前又發生新的損傷，如此殘留損傷的累積稱為功能蓄積。

致畸性（Teratogenicity）：受試樣品在胚胎髮育期引起胎仔永久性結構和功能異常的效應。

生殖毒性（Reproduction Toxicity）：受試樣品對親代繁殖功能或能力的影響和/或對子代生長發育的損害效應。

生長發育毒性（Developmental Toxicity）：妊娠動物接觸受試樣品而引起的子代在出生以前、圍產期和出生以後所顯現出的機體缺陷或功能障礙。

無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在規定的試驗條件下，用現有的技術手段或檢測指標未觀察到任何與受試樣品有關的毒性作用的最大染毒劑量或濃度。

最低可見有害作用水平（Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL）：在規定的試驗條件下，受試樣品引起實驗動物形態、功能、生長發育等發生有害改變的最低染毒劑量或濃度。

慢性毒性（Chronic Toxicity）：實驗動物在其正常生命期的大部分時間內接觸受試樣品所引起的健康損害效應。

致癌作用（Carcinogenesis）：受試樣品引起腫瘤發生率和/或類型增加、潛伏期縮短的效應。

基線劑量（Benchmark Dose, BMD）：由於NOAEL和 LOAEL都是實驗中的具體劑量值，易受每組樣本含量大小和組間距寬窄等因素影響，故設定基線劑量，可選擇ED1（機率為1%的受試個體出現效應的劑量），或選擇ED5（機率為5%的受試個體出現效應的劑量）或ED10（機率為10%的受試個體出現效應的劑量）的95%可信限下限。

毒物代謝動力學（Toxicokinetics）：定量研究毒物在體內吸收、分布、生物轉化、排泄等過程隨時間變化的動態規律的學科。

安全係數（Safety Factor，SF）：在以動物試驗數據外推到人，或以小範圍人群調查結果判斷所評價的化學品對大範圍人群的有害作用時，為排除所涉及的不確定因素而設定的係數，用於制定化學品控制標準，以保證接觸人群的安全。

危險性參考劑量（Risk Reference Dose，RfD）：危險度達到可接受程度的劑量。

危險性參考濃度（Risk Reference Concentration，RfC）：危險度達到可接受程度的濃度。

日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI）：終身每日攝入化學物而不引起可檢出的健康損害效應的劑量，一般以mg/kg bw.d表示。

（致癌物的）實際安全劑量（Visual Safe Dose，VSD）：化學品引起致癌率有99%的把握低於10的劑量水平。

職業接觸限值（Occupational Exposure Limit，OEL）：是職業性有害因素的接觸限制量值，指勞動者在職業活動過程中長期反覆接觸對機體不引起急性或慢性有害健康影響的容許接觸水平。

最高容許濃度（Maximal Allowable Concentration，MAC）：指工作地點、在一個工作日內、任何時間均不應超過的有毒化學物的濃度。

鑑定程式和方法

化學品毒性鑑定分為4個階段

（1）第一階段（急性毒性試驗、眼刺激試驗和皮膚刺激試驗）

主要是急性毒性參數的測定和了解受試樣品對皮膚、黏膜的刺激性以及致敏性，為毒性分級和標籤管理提供依據。同時，可了解受試樣品對機體造成急性損害的可能性和嚴重程度，並為第二階段各項試驗的劑量設計提供依據。在測定LD50時，一般要求用兩種動物，染毒途徑應包括所有人體可能的接觸途徑。

· 急性吸入毒性試驗

· 急性經皮毒性試驗

· 急性經口毒性試驗

· 急性眼刺激性/腐蝕性試驗

· 皮膚刺激性/腐蝕性試驗

· 皮膚變態反應試驗（皮膚致敏試驗）

（2）第二階段（亞急性毒性試驗和致突變試驗）

主要是了解受試樣品的亞急性毒性和遺傳毒性，為第三階段各項試驗劑量設計和觀察指標的選擇提供依據，並對受試樣品的致癌性進行預測。

· 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）

· 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

· 體內哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗

· 體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

· 哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗，或

· 精子畸形試驗

· 嚙齒類動物顯性致死試驗

· 免疫毒性評價試驗方法

· 亞急性吸入（14/28天）毒性試驗

· 亞急性經皮（21/28天）毒性試驗

· 亞急性經口（28天）毒性試驗

（3）第三階段（亞慢性毒性試驗、致畸試驗、繁殖試驗）

通過亞慢性試驗進一步確定多次重複染毒的毒作用性質和靶器官，初步確定NOAEL或LOAEL，為第四階段各項試驗的劑量設計和觀察指標的選擇提供依據；通過致畸試驗判斷受試樣品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通過繁殖試驗，可判斷受試樣品對生殖過程的損害作用。通過遲發性神經毒性試驗，可判斷受試樣品是否具有遲發性神經毒作用。

· 亞慢性吸入毒性試驗

· 亞慢性經皮毒性試驗

· 亞慢性經口毒性試驗

· 致畸試驗

· 兩代繁殖毒性試驗

· 遲發性神經毒性試驗

（4）第四階段（慢性毒性試驗和致癌試驗）

通過慢性毒性試驗可確定受試樣品的NOAEL和LOAEL，為推算受試樣品的安全接觸限值提供依據。通過致癌試驗可以確定受試樣品對受試實驗動物的致癌性。通過代謝動力學試驗可以了解受試樣品的吸收、分布、代謝和排泄特點，了解蓄積毒性作用及其可能的靶器官和毒作用機理。

· 慢性吸入毒性試驗

· 慢性經皮毒性試驗

· 慢性經口毒性試驗

· 致癌試驗或慢性毒性試驗合併致癌試驗

· 毒物代謝動力學試驗

參考方法

· 皮膚變態反應試驗-局部淋巴結法

· 大腸桿菌回復突變試驗

· 酵母菌基因突變試驗

· 體外哺乳動物細胞正向基因突變試驗

· 果蠅伴性隱性致死試驗

· 枯草桿菌基因重組試驗

· 體外哺乳動物細胞程式外DNA合成（UDS）試驗

· 體內哺乳動物外周血細胞微核試驗

· 體外哺乳動物姊妹染色單體交換（SCE）試驗

· 體內哺乳動物骨髓細胞姊妹染色體交換（SCE）試驗

· 繁殖/生長發育毒性篩選試驗

· 亞急性毒性合併繁殖/發育毒性篩選試驗

· 一代繁殖試驗

· 神經毒性篩選組合試驗

選擇原則

6.1試驗項目的選擇應當根據化學品的理化特性，特別是通過對其化學結構與活性關係進行初步分析，並儘量了解其使用範圍、生產或使用過程、人體接觸情況和現有文獻資料，根據具體情況選擇系統的或補充的毒性試驗。在化學品毒性鑑定過程中，根據各階段的試驗結果，有針對性地取捨進一步試驗的項目和觀察指標，以完善對該化學品所做出的毒性鑑定資料的科學性和可靠性。

6.2受試樣品的染毒途徑應與人體可能接觸的途徑一致，對人體有可能通過呼吸道、皮膚和消化道三種途徑接觸的化學品，應進行吸入、經皮和經口三種染毒途徑的各項試驗；常溫下呈氣態的化學品一般不進行經口染毒途徑的各項試驗；20℃蒸氣壓≤1×10 Pa的非粉末狀化學品一般不需進行吸入染毒途徑的各項試驗。

6.3對有可能與皮膚或眼睛接觸的化學品，應進行皮膚或眼刺激性試驗；如化學品的pH≤2或≥11，則不必進行皮膚和黏膜的刺激試驗，並認為其對皮膚和眼有腐蝕作用。

6.4對有可能與皮膚反覆接觸的化學品，應進行皮膚致敏試驗；經皮毒性屬高毒以及對皮膚有腐蝕作用的化學品則不進行皮膚致敏試驗。

6.5我國首創或根據國內外文獻報導首次生產的化學品，原則上需進行4個階段的毒理學試驗。首先必須做急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗、三項致突變試驗（包括基因水平和染色體水平的體外、體內試驗）、致畸試驗和繁殖試驗。根據試驗結果，判斷是否需繼續做其它試驗項目。

6.6引進國外的生產技術，生產國外已登記生產和批准套用的化學品，如國內的生產單位能證明所生產化學品的理化性質、純度、主要雜質成分及含量均與國外同類化學品一致時，可先進行第一階段和兩項致突變試驗（包括基因水平和染色體水平兩種類型的試驗）。如試驗結果與國外同類化學品一致，可不繼續進行第三階段和第四階段試驗。

6.7與國內已獲批准生產的化學品屬同類化學品的，如國內的生產單位能證明所生產化學品的理化性質、純度、主要雜質成分及含量均與國內同類化學品一致時，可先進行急性毒性試驗和一項致突變試驗。如試驗結果與國內同類化學品一致，可不繼續進行試驗。

6.8凡將兩種以上的化學品混配成新的製劑時，除必須按相應要求對其成分分別進行試驗外，還應進行急性聯合毒性試驗，如有明顯的協同作用，則根據具體情況對該製劑進行必要的其它毒性試驗。

6.9致突變試驗的選擇原則

6.9.1進行3項致突變試驗的化學品，如2項或3項試驗結果為陽性，應進行致癌試驗。如僅1項試驗結果為陽性，應增做另一項同類型的致突變試驗，如結果仍為陽性，應進行致癌試驗；如結果為陰性，可不繼續進行試驗。如3項結果均為陰性，可不繼續進行試驗。

6.9.2進行2項致突變試驗的化學品，如2項試驗結果為陽性，應進行第三階段和第四階段的相應試驗。如僅1項試驗結果為陽性，應增做另一項同類型的致突變試驗。如結果仍為陽性，應進行第三階段和第四階段的相應試驗；如結果為陰性，可不繼續進行試驗。如2項結果均為陰性，可不繼續進行試驗。

6.9.3進行1項致突變試驗的化學品，如試驗結果為陽性，應增做另一項同類型的致突變試驗。如結果仍為陽性，應進行第三階段和第四階段的相應試驗。如結果為陰性，可不繼續進行試驗。

受試樣品的規定

7.1受試樣品必須是按照既定的生產工藝和配方進行規範化生產的產品，其成分和濃度與實際生產、經營和使用的產品相同。

7.2提供與受試樣品毒性有關的物理、化學性質資料

7.2.1化學名稱、CAS編號、結構式

7.2.2測定方法、純度、所含主要雜質、光譜圖

7.2.3性狀、氣味、穩定性（熱、空氣、光）

7.2.4密度、熔點（℃）、沸點（℃）、閃點、蒸氣壓（Pa ℃）、表面張力（N/M ℃）、水中溶解度（mg/L ℃）、脂溶性（mg/100g ℃，說明溶劑種類）、脂水分配係數（說明溶劑種類）、膨脹係數、爆炸極限、pH值、一定pH值下的水解情況

7.3提供原料來源、生產工藝、人的可能攝入量、使用說明書等有關資料

7.4對受試樣品的處理

7.4.1受試樣品應新鮮配製。除非有資料表明以溶液（或乳濁液、懸濁液等）保存具有穩定性。固體受試樣品應溶於或懸於適當的賦形劑（溶劑或載體）中，並進行稀釋。液體受試樣品可直接使用或稀釋後使用。根據受試樣品的理化性質（水溶性和/或脂溶性）確定受試樣品所用的賦形劑。所用賦形劑在使用劑量水平對實驗動物、菌株或細胞應不產生毒作用，且不與受試樣品發生任何化學反應，並能保持受試樣品的穩定性。通常用蒸餾水、等滲鹽水、植物油、食用澱粉、羧甲基纖維素等。如不是常用賦形劑，應有參考資料說明其成份。

7.4.2對膨脹係數較高的化學品應考慮膨脹係數對試驗結果的影響，急性經口毒性試驗中的最高劑量應為實驗動物能夠耐受的最大染毒劑量，並根據試驗結果確定其它試驗的劑量設計，如最大染毒劑量未觀察到明顯毒性效應，則體內致突變試驗、亞急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗的最高劑量均應達到實驗動物能夠耐受的最大染毒劑量。

7.4.3如果將受試樣品摻入飼料或溶於飲水中進行染毒，受試樣品在飼料或飲水中的含量應恆定並進行穩定性監測。受試樣品的添加量不能破壞飼料中的營養平衡。實驗動物應單籠飼養，必須用減重法稱量每周的食物攝入量（如果受試樣品是加入飲水中染毒的，也應測量水的攝入量），並通過食物或飲水的消耗情況計算動物對受試樣品的攝入量。

評價結果

將其外推到人的意義是有限的。儘可能結合人群觀察資料，作出科學的綜合性評價。

8.1在使用NOAEL或LOAEL等對化學品的安全性進行評價時，可根據情況調整安全係數（例如對於在試驗或流行病學調查中發現有致癌或致畸作用的化學品，安全係數可增大至100～1000。在制定工作場所空氣中化學品職業接觸限值（OEL）時，應更注重流行病學調查資料，參考動物試驗數據，一般以動物試驗的NOAEL或LOAEL為基準，安全係數可以小於20。

可按下列公式計算得出各種衛生限值。

式中SF1×SF2×SF3……×SFn 代表從各個角度考慮的安全係數，在計算ADI時一般以100作為安全係數（SF=10(種屬差異)×10(個體差異)）。

8.2在套用致突變試驗結果篩選致癌物時，套用下列計算式計算致突變性陽性結果預期致癌性的機率：

式1：

式1適用於對同一種致突變試驗結果的推算，式中M和M為致突變試驗結果的陽性數和陰性數；C和C為致癌性的有和無。

式2：

式2適用於對多種致突變試驗結果的推算，要求各致突變試驗是互相獨立的，一般認為反映不同遺傳學終點的試驗基本相互獨立，如多個試驗的檢測終點為同一遺傳學終點，只能將其中一個試驗的結果納入推算，如檢測終點相同的試驗方法的結果既有陽性又有陰性，則將呈陽性的試驗方法的結果納入推算。設陽性結果有K個，相應的靈敏度為a1，a2…aK(a=1-P(M/C))，相應的特異度為a1,a2…aK(a=1-P(M/C))，同時設陰性結果有N個，相應的靈敏度為d1，d2…dK(d=1-P(M/C))，相應的特異度為d1,d2…dK (d=1-P（M/C）)

式中PK（M/C）= a1×a2…×aK

PK（M/C）= （1-a1）×（1-a2）…×（1-aK）

PN（M/C）= d1×d2…×dK

PN（M/C）= （1-d1）×（1-d2）…×（1-dK）

當估算結果P（C/M）≥0.5時應考慮進行動物致癌試驗，機率越高，進行動物致癌試驗的必要性越大。當P（C/M）≤0.03時，如沒有理由認為該化學品屬於非遺傳致癌物，可暫不考慮進行動物致癌試驗。

8.3在對化學品的致畸性進行評價時，我國常用致畸指數（雌鼠LD50/最小致畸劑量）和致畸危害指數（最大不致畸劑量/最大可能攝入量），並按照計算結果進行分級，但由於不同化學品的急性致死劑量-反應關係曲線的情況不一，所以，可換用LD1、LD5或以雌鼠體重降低（與對照組相比降低一定的百分比）的劑量，目前推薦以BMD和安全係數對化學品的致畸性進行評價。

8.4由於誘癌作用無閾值，因此，在對化學品的致癌危險度進行評定時採用實際安全劑量，即化學品引起致癌率有99%的把握低於10的劑量水平。

鑑定機構要求

從事化學品毒性鑑定的機構應符合《化學品毒性鑑定管理規範》中“化學品毒性鑑定實驗室條件及工作準則（GLP）”的各項要求，並根據獲得資質的等級從事相應項目的化學品毒性鑑定工作。

動物實驗室要求

10.1對實驗動物的要求

10.1.1實驗動物的基本選擇原則

10.1.1.1必須使用具有合格證的實驗動物（尚未實行等級管理的動物種屬除外）。

10.1.1.2應儘量選用各項試驗的首選動物，如選擇其他種屬應說明原因並確定該種屬對所檢測的毒性作用敏感。

10.1.2動物試驗的一般要求（某些試驗對實驗動物有特殊要求，則以試驗方法中所列的要求為準）：

10.1.2.1用於同一項試驗的同性別動物，在進行試驗前個體之間的體重相差最多不超過20%。

10.1.2.2雌性動物一般應為未交配過的。

10.1.2.3實驗動物在實驗環境中需適應至少3～5天后才能開始染毒。

10.1.2.4在同一次試驗中需多次進行經口染毒時，至少每周對受試動物進行稱重並根據體重調整每隻動物的染毒體積。

10.1.3動物福利要求

應儘量減少實驗動物的使用量，同時為實驗動物提供足夠的空間，以供動物採取正常的適應姿勢，並且能夠有適當的移動自由；應提供足夠的合格飼料和飲水；在試驗過程中應儘量減輕動物的痛苦，不得虐待動物。

10.2進行各項動物試驗的動物實驗室應符合國家法律法規的有關規定並獲得主管部門頒發的合格證。

10.3用於動物試驗的飼料、飲水、墊料、籠具等應符合國家法律法規的有關規定（飼料應具有主管部門頒發的合格證）。

10.4 實驗動物管理及從事動物試驗的人員，必須經培訓、考核，持證上崗。

鑑定報告內容

11.1受試樣品名稱、理化性狀、配製方法、所用濃度、經口染毒需註明染毒體積。

11.2體內試驗需註明：實驗動物的種屬、品系和來源（註明合格證號和動物級別）、性別、體重範圍（周齡）、單籠餵養還是群飼；實驗動物飼養環境，包括飼料來源（如非標準飼料，應註明飼料的配方）、室溫、相對濕度，動物實驗室和飼料的合格證號；劑量設計和動物分組方法，每組所用動物性別、數量及初始體重範圍。

11.3體外試驗需註明：使用的菌株或細胞種類、使用的培養基、培養濃度、培養溫度、培養時間、代謝活化系統；劑量水平、對照組設定、陽性物種類和劑量。

11.4主要操作步驟（如為吸入染毒應註明染毒設備中的氣流速度等參數）。

11.5各項檢測指標的測定方法及主要檢測儀器的名稱和型號。

11.6檢測結果數據統計學處理方法以及各項參數的計算方法。

11.7體內試驗需描述染毒後動物中毒表現及出現時間和恢復情況、死亡時間、大體解剖和屍檢所見，進行病理組織學檢查的需描述觀察結果。

11.8列表報告各項指標測定結果（一般以 的形式表達），並列出經計算所得的毒理學參數。

11.9結論。

範圍

本方法規定了動物急性吸入毒性試驗的基本原則、技術和要求。

本方法適用於評價氣體、揮發性物質或氣溶膠/顆粒物等化學品的急性吸入毒性作用。

規範性引用檔案

OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.403. Feb. 1981)

OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.433. Feb. 2002)

試驗目的

3.1 檢測化學品對實驗動物的急性吸入毒性作用和強度。

3.2 為亞急(慢)性等吸入毒性試驗提供劑量選擇的依據。

定義

4.1 急性吸入毒性(Acute Inhalation Toxicity): 實驗動物短時間（24h內）持續吸入一種可吸入性受試樣品後，在短期內出現的健康損害效應。

4.2 半數致死濃度（Median Lethal Concentration,LC50）: 指在一定時間內經呼吸道吸入受試樣品後引起受試動物發生死亡的機率為50%的濃度。以單位體積空氣中受試樣品的質量(mg/m)來表示。

4.3 劑量-反應關係(Dose-response Relationship)：表示化學毒物的劑量與某一群體中質效應的發生率之間的關係。

試驗基本原則

各試驗組動物在一定時間內吸入不同濃度的受試樣品，染毒濃度的選擇可通過預試驗確定。染毒後觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行屍檢，試驗結束時仍存活的動物要處死並進行大體解剖。

試驗方法

6.1 實驗動物

首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別各劑量組個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在試驗環境中至少適應 3～5d時間。

6.2 劑量設計

根據所選方法的要求，原則上應設4～5個劑量組，每組動物一般為10隻，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試樣品毒性很低，也可採用一次限量法，即用20隻動物（雌雄各半），10000 mg/m吸入2h或 5000 mg/m吸入4h，如未引起動物死亡，則不再進行多個劑量的急性吸入毒性試驗。

6.3 染毒

染毒可採用靜式染毒法或動式染毒法。

6.3.1 靜式染毒法

靜式染毒是將實驗動物放在一定體積的密閉容器（染毒櫃）內，加入一定量的受試樣品，並使其揮發，造成試驗需要的受試樣品濃度的空氣，一次吸入性染毒2h。

6.3.1.1 染毒櫃的容積以每隻染毒小鼠每小時不少於3L空氣計，每隻大鼠每小時不少於30L計。

6.3.1.2 染毒濃度的計算：染毒濃度一般應採用實際測定濃度。在染毒期間一般可測4～5次，求其平均濃度。在無適當測試方法時。可用下式計算染毒濃度

C=(a×d/v) ×10

式中：

C-- 染毒濃度(mg/m)

a-- 加入受試樣品的量(ml)

d-- 化學品密度

v-- 染毒櫃容積(L)

6.3.2 動式染毒法

動式染毒是採用機械通風裝置，連續不斷地將含有一定濃度受試樣品的空氣均勻不斷地送入染毒櫃，空氣交換量大約為12～15次/h，並排出等量的染毒氣體，維持相對穩定的染毒濃度（對通過染毒櫃的流動氣體應不間斷地進行監測，並至少記錄 2 次）。一次吸入性染毒2h。當受試化合物需要特殊要求時，套用其它的氣流速率。染毒時，染毒櫃內應確保至少有19%的氧含量和均衡分配的染毒氣體。一般情況下，為確保染毒櫃內空氣穩定，實驗動物的體積不應超過染毒櫃體積的5%。且染毒櫃內應維持微弱的負壓，以防受試樣品泄露污染周圍環境。同時，應注意防止受試樣品爆炸。

6.3.2.1 受試樣品氣化（霧化）和輸入的常用方法

6.3.2.1.1 氣體受試樣品，經流量計與空氣混合成一定濃度後，直接輸人染毒櫃。

6.3.2.1.2 易揮發液體受試樣品，通過空氣鼓泡或適當加熱促使揮發後輸人染毒櫃。

6.3.2.1.3 若受試樣品現場使用時採取噴霧法時，可採用噴霧器或超聲霧化器使其霧化後輸入染毒櫃。

6.3.2.2 染毒濃度計算

染毒濃度一般應採用動物呼吸帶實際測定濃度，每半小時一次，取其平均值。各測定濃度值應在其平均值的25%以內。若無適當的測試方法，也可採用以下公式計算染毒濃度：

C=[a×d/(v1+v2)] ×10

式中：

C-- 染毒濃度(mg/m)

a-- 氣化或霧化受試樣品的量(ml)

d-- 受試樣品密度

v1-- 輸入染毒櫃風量(L)

v2-- 染毒櫃容積(L)

6.4 觀察期限及指標

6.4.1 觀察並記錄染毒過程和觀察期內的動物中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，觀察指標見附錄1-A，LC50的計算見附錄1-B。

6.4.2 對死亡動物進行屍檢。觀察期結束後，處死存活動物並進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。

6.5 試驗結果評價

評價試驗結果時，應將LC50與觀察到的毒性效應和屍檢所見相結合考慮，LC50值是受試樣品急性毒性分級和標籤標識以及判定受試樣品經呼吸道吸入後引起動物死亡可能性大小的依據。引用LC50值時一定要註明所用實驗動物的種屬、性別、染毒方式及時間長短、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試樣品與動物異常表現（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其它毒性作用）的發生率和嚴重程度之間的關係。急性吸入毒性分級見附錄1-C。

鑑定報告

鑑定報告應包括如下內容：

7.1 受試樣品名稱、理化性狀、配製方法、所用濃度；

7.2 動式染毒設備中的氣流速度；

7.3 實驗動物的種屬、品系和來源（註明合格證號和動物級別）;

7.4 實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實驗室合格證號；

7.5 所用染毒濃度和動物分組，每組所用動物性別、數量及體重範圍；

7.6 計算LC50的方法；

7.7 染毒後動物中毒表現及出現時間和恢復情況、死亡時間、大體解剖所見；

7.8 列表報告結果（建議的表格形式見附錄1-D），計算的LC50及其95%可信區間；

7.9 結論。

試驗結果的解釋

通過LC50的測定，可評價受試樣品的急性吸入毒性及其毒性分級(見附錄1-C),但其結果外推到人類的有效性是有限的。

急性經皮毒性試驗

Acute Dermal Toxicity Test

範圍

本方法規定了動物急性經皮毒性試驗的基本原則、技術和要求。

本方法適用於評價化學品的急性經皮毒性。

規範性引用檔案

OECD GUIDELINE FOR TESTING CHENICALS（No.402.1995）

USEPA OPPTIS Health Effects (Series 870.1200 June 1996)

試驗目的

確定受試樣品能否經皮膚吸收和短期經皮染毒所產生的毒性作用和強度，並為確定亞急（慢）性經皮毒性及其它試驗的劑量設計提供試驗依據。

定義

4.1 急性經皮毒性(Acute Dermal Toxicity):受試樣品一次或在24 h 內多次經皮膚染毒所產生的健康損害效應。

4.2 經皮半數致死劑量（Dermal Median Lethal Dose）:一次或在24 h 內多次經皮膚染毒受試樣品引起50%實驗動物死亡的劑量，以mg/kg bw表示。

4.3 劑量-反應關係(Dose-response Relationship)：表示化學毒物的劑量與某一群體中質效應的發生率之間的關係。

試驗基本原則

在試驗前，先去除實驗動物受試部位的被毛。將實驗動物分成若干劑量組，每組塗布不同劑量的受試樣品，而後觀察實驗動物中毒反應和死亡情況，計算LD50。對試驗中死亡的動物做大體解剖和病理學檢查，對試驗結束時的存活動物也應做大體解剖。注意排除受試樣品引起的皮膚局部刺激或腐蝕作用所致的全身效應。

試驗方法

6.1 受試樣品配製

固體受試樣品應研磨，過100目篩。用適量無毒無刺激性賦形劑混勻，以保證受試樣品與皮膚良好的接觸。常用的賦形劑有水、植物油、凡士林、羊毛脂等。液體受試樣品一般不必稀釋，可直接用原液試驗。

6.2 實驗動物

首選大鼠，也可選用豚鼠或家兔。實驗動物體重要求範圍分別為：大鼠200～300g，豚鼠350～450g，家兔2000～3000g。

試驗期間，為避免實驗動物相互抓撓，應採用單籠餵養。

試驗前24h，在動物背部正中線兩側剪毛或剃毛，仔細檢查皮膚，要求完整無損，以免改變皮膚的通透性。去毛面積不應少於實驗動物體表面積的10%。各類動物體表面積的數值和計算方法見附錄1-E。

6.3 劑量和分組

實驗動物隨機分為4～5個劑量組。若使用水、植物油、凡士林、羊毛脂外的賦形劑，則需設賦形劑對照組。豚鼠或大鼠每一劑量組（單性別）不少於5隻；家兔每一劑量組（單性別）不少於4隻。

各劑量組間要有適當的組距，可按等比或等差級設定劑量，以使各劑量組實驗動物產生的毒性反應和死亡率呈現劑量-反應（效應）關係。

一般情況下，如果劑量達到2000mg/kg bw仍不出現實驗動物死亡時，則不需要再進行高劑量試驗。

6.4 試驗步驟

選擇適當方法固定好實驗動物，將受試樣品均勻塗布於實驗動物的去毛區，並用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以保證受試樣品和皮膚的密切接觸，防止脫落和動物舔食受試樣品。塗布4h後取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當的溶劑洗去皮膚上殘留的受試樣品。

6.5 觀察期限及指標

觀察並記錄染毒過程和觀察期內的動物的中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，全面觀察中毒的發生、發展過程和規律以及中毒特點和毒作用的靶器官，觀察指標見附錄1-A，LD50的計算見附錄1-B。

對死亡動物進行屍檢。觀察期結束後，處死存活動物並進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。

試驗結果評價

按附錄1-B計算LD50，按附錄1-C進行急性經皮毒性分級。

鑑定報告

鑑定報告應包括以下內容：

8.1 實驗動物種屬品系、來源、飼養環境、飼料和飲水；

8.2 按劑量組列表(見附表1-D)說明每組動物數、性別狀況、出現毒效應的動物數、死亡動物數；

8.3 染毒時間、染毒持續時間、染毒後動物中毒的主要表現；

8.4 LD50計算方法；

8.5 LD50值及其95%可信區間（包括雌、雄實驗動物各自的LD50）；

8.6 病理組織學檢查結果；

8.7 結論。

試驗結果的解釋

經皮LD50是評價化學物急性毒性的重要參數之一，也是急性毒性分級的依據。但LD50僅表示受試樣品經皮吸收引起實驗動物死亡50%的劑量，並不能全面反映受試樣品經皮吸收的所有急性毒性特徵，因此，評價一受試樣品經皮急性毒性既要考慮其對某一品系實驗動物的經皮LD50值，又要考慮其中毒症狀表現及反應出現的早晚和持續時間的長短，並結合體重變化與病理學檢查結果等，經綜合分析才能得出經皮急性毒性較為全面的評價。

急性經口毒性試驗

範圍

本方法規定了動物急性經口毒性試驗的基本原則、技術和要求。

本方法適用於評價化學品的急性毒性作用。

規範性引用檔案

OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 )

OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 )

USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)

試驗目的

3.1 檢測化學品對實驗動物的急性毒性作用和強度。

3.2 為亞急(慢)性等毒性試驗提供劑量選擇的依據。

3.3 試驗結果可作為化學品急性毒性分級和標籤標識。

定義

4.1 急性經口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h內多次經口給予實驗動物受試樣品後，動物在短期內出現的健康損害效應。

4.2 經口半數致死劑量（Oral Median Lethal Dose）: 經口一次或24h內多次經口給予受試樣品後，引起實驗動物總體中半數死亡的毒物的統計學劑量。以單位體重接受受試樣品的質量(mg/kg bw或g/kg bw)來表示。

4.3 劑量-反應關係(Dose-response Relationship)：表示化學毒物的劑量與某一群體中質效應的發生率之間的關係。

試驗基本原則

以經口灌胃法給予各試驗組動物不同劑量的受試樣品，每組用一個劑量，染毒劑量的選擇可通過預試驗確定。染毒後觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行屍檢，試驗結束時仍存活的動物要處死並進行大體解剖。本方法主要適用於嚙齒類動物的研究，但也可用於非嚙齒類動物的研究。

試驗方法

6.1 受試樣品的處理

受試樣品應溶解或懸浮於適宜的賦形劑中，（不溶性固體或顆粒狀物質研磨、過100目篩）建議首選水或食用植物油（如玉米油）作溶劑，也可考慮使用其它賦形劑（如羧甲基纖維素、明膠、澱粉等）等配成混懸液；不能配製成混懸液時，可配製成其它形式(如糊狀物等)，但不能採用具有明顯毒性的有機化學溶劑。如採用有毒性的溶劑應單設溶劑對照組觀察。

6.2 實驗動物

首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別實驗動物個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在試驗環境中至少適應3～5d時間。

6.3 劑量設計

根據所選方法的要求，原則上應設4～5個劑量組，每組動物一般為10隻，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試樣品毒性很低，也可採用最大限量法，即用20隻動物（雌雄各半），採用5000mg/kg bw劑量，如未引起動物死亡，可不再進行多個劑量的急性經口毒性試驗。

6.4 試驗步驟

6.4.1 試驗前實驗動物應禁食（一般16h左右），不限制飲水。若採用代謝率高的其它動物，禁食時間可以適當縮短。

6.4.2 正式試驗時，稱量動物體重，隨機分組，然後對各組動物用經口灌胃法一次染毒。各劑量組的灌胃體積應相同, 小鼠常用容量為20ml/kg bw，大鼠常用容量為10ml/kg bw。若一次給予容量太大，也可在24h內分2～3次染毒（每次間隔4h～6h），但合併作為一次劑量計算。染毒後繼續禁食3h～4h。若採用分批多次染毒，根據染毒間隔長短，必要時可給動物一定量的食物和水。

6.4.3 觀察期限及指標

觀察並記錄染毒過程和觀察期內的動物的中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，觀察指標、LD50的計算及試驗記錄形式分別見附錄1-A、1-B、1-D。

對死亡動物進行屍檢。觀察期結束後，處死存活動物並進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。

6.5 可採用多種方法測定LD50，建議採用霍恩氏法、寇氏法、機率單位-對數圖解法、最大耐受量試驗和上-下法等(見附錄1-B)。

鑑定報告

鑑定報告應包括如下內容：

7.1 受試樣品名稱、理化性狀、配製方法、所用濃度；

7.2 實驗動物的種屬、品系和來源（註明合格證號和動物級別）;

7.3 實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實驗室合格證號；

7.4 所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數量及體重範圍；

7.5 染毒後動物中毒表現和死亡情況及出現時間，大體解剖及病理所見；

7.6 計算LD50的方法及其LD50和95%可信限；

7.7 列表報告結果（建議的表格形式見附錄D）；

7.8 結論。

試驗結果的解釋

通過急性經口毒性試驗和LD50的測定可評價受試樣品的急性經口毒性、急性經口毒性分級，其結果外推到人類的有效性很有限。

腐蝕性試驗

Acute Eye Irritation/Corrosion Test

範圍

本規範規定了動物急性眼刺激/腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法

本規範適用於檢測化學物的眼睛刺激性/腐蝕性。

規範性引用檔案

OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 405，Feb.1987)

USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series 870.2400, Aug.1998)

試驗目的

確定評價化學物對哺乳動物眼睛是否有刺激作用/腐蝕作用及其程度。

定義

4.1 眼睛刺激性(Eye Irritation)：指眼球表面接觸受試樣品後產生的可逆性炎性變化。

4.2 眼睛腐蝕性(Eye Corrosion)：指眼球表面接觸受試樣品後引起的不可逆性組織損傷。

試驗基本原則

5.1 受試樣品以一次劑量滴入每隻實驗動物的一側眼睛結膜囊內，以未作處理的另一側眼睛作為自身對照；

5.2 在規定的時間間隔內，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度並評分，以此評價受試樣品對眼睛的刺激作用。觀察時間應能足以評價刺激效應的可逆性和不可逆性。觀察時間最少72h，但一般不超過21d；

5.3 當動物出現嚴重和持久的痛苦跡象時，以適當的方式將動物處死；

5.4 強酸或強鹼物質如pH≤2或pH≥11.5，由於其可預見的腐蝕特性，不必做本試驗；

5.5 已在皮膚試驗中證實具有腐蝕或嚴重刺激毒性的物質不必進行眼刺激試驗，可以推測該物質對眼睛將會引起相似的嚴重結果；

5.6 在充分並公認的體外試驗結果中確定可能產生刺激性或腐蝕性的物質不必進行體內試驗。

試驗方法

6.1 受試樣品：液體、固體或半固體、顆粒物。

6.2 實驗動物和飼養環境

6.2.1 動物種屬

首選健康成年白色家兔，體重2～3kg。如果使用其它的哺乳動物做試驗，試驗者應提供選擇的依據。

6.2.2 動物數量

如果受試樣品的顯著效應是可預見的，可以考慮用一隻動物。如果用一隻動物試驗得出的結果提示受試樣品有嚴重的刺激性和腐蝕性，則不必進行進一步的試驗。如果結果相反，則至少需要3隻家兔。有時，在增加動物的進一步試驗中應該適當的闡明可疑反應。

6.2.3 飼養環境

動物實驗室應符合國家相應規定。常規飼料餵養，自由飲水。

6.3 劑量設計

對於液態受試樣品，一般不需稀釋，可直接使用原液，染毒量為0.1ml。若受試樣品為固態或顆粒狀，應將其研磨成細粉狀，過200目篩，染毒量應為100mg。

氣溶膠產品需噴至容器中，收集其液體再使用。對揮發性物質，劑量可以通過使用前後稱量容器質量進行估計。

6.4 試驗步驟

6.4.1 試驗前眼睛的檢查

試驗前動物要在動物實驗室環境中至少適應3d時間。試驗前24h，要對實驗動物的兩隻眼睛進行常規檢查。有眼睛刺激症狀、角膜缺陷或結膜損傷的動物不能用於試驗。

6.4.2 染毒

6.4.2.1 輕輕拉開實驗動物一側眼睛的下眼瞼，將受試樣品0.1ml(100mg)滴入(或放入)結膜囊中，使上、下眼帘被動閉合1s，以防止受試樣品丟失。未處理的另一側眼睛作為自身對照。

6.4.2.2 滴入受試樣品24h內不沖洗眼睛，如果認為必要，在24h時可進行沖洗。

6.4.2.3 如果受試樣品有明顯的刺激徵象，另選3隻動物進行沖洗試驗。在滴入受試樣品30s後，用生理鹽水沖洗5min，水的流量和流速都不應導致眼損傷。

6.4.3 觀察周期

觀察時間最少要72h，也不能嚴格固定不變，但必須足夠以充分評估觀察到的可逆或不可逆效應。通常觀察時間一般不超過21d。

6.4.4 臨床檢查和評分

6.4.4.1 在滴入受試樣品後的第1h，24h，48h,72h和96h對眼睛進行檢查，如果72h時未出現刺激反應，可終止試驗。如果發現累及角膜或有其它眼刺激作用，7d內不恢復者，為確定該損害的可逆性或不可逆性需延長觀察時間，一般不超過21d。除了對角膜、虹膜、結膜進行觀察外，其它損害效應都應記錄並報告。在24h觀察和記錄結束後，可使用螢光素鈉對所有動物的眼睛作進一步檢查。在每次檢查中均應按表1記錄眼的刺激反應，並按表2進行眼刺激強度評價。

6.4.4.2 在進行檢查時，可使用放大鏡、手持裂隙燈，並按表3記錄

*實驗條件：不沖洗/30秒後沖洗

6.5.2 結果的評價

眼刺激評分應與觀察到的反應的性質和可逆性或其它方面結合進行評價。單獨的積分值不能作為受試樣品的刺激性質的最後評判，應將所有觀察結果及各種因素進行綜合評價。

鑑定報告

除一般鑑定報告的內容外，還應包括以下方面：

7.1 表格記錄每隻動物每個時間點（如1h, 24h, 48h，72h和4d,7d）的刺激反應；

7.2 具體描述除眼部以外的其它作用；

7.3 刺激/腐蝕程度和性質的描述；

7.4 描述在各觀察時點積分時的檢查方法（如裂隙燈、生物顯微鏡、螢光素染色）；

7.5 結論。

試驗結果的解釋

急性眼刺激試驗結果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數情況下對有刺激性或腐蝕性的物質較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結果，則會增加從動物外推到人的可靠性。